Caracterização dos mecanismos moleculares de interação entre fungos patogênicos e Acanthamoeba castellanii como abordagem para origem de fatoresde virulência fúngica

De acordo com a Organização Mundial da Saúde, cerca de 3,4 milhões de pessoas morrem todos os anos devido ao consumo de água contaminada, falta de saneamento básico e higiene. A contaminação microbiológica das águas tem grande contribuição das amebas de vida livre (AVLs). As AVLs são caracterizadas por serem bastante resistentes às adversidades do meio ambiente, bem como a germicidas. Portanto, são excelentes reservatórios para diversas bactérias, vírus e fungos encontrados no ambiente, como Legionella pneumophila, Mycobacterium sp., Escherichia coli e adenovírus. No caso de fungos especificamente, AVLs, como Acanthamoeba castellanii têm sido descritas como possíveis hospedeiros ambientais para uma ampla variedade de patógenos causadores de micoses como Cryptococcus spp., Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenkii e Blastomyces dermatitides. Entretanto, os mecanismos envolvidos nesta interação não estão completamente elucidados. O objetivo desta dissertação é caracterizar molecularmente as instancias que tornam as AVLs capazes de interagir e carrear diferentes patógenos fúngicos, levando a uma seleção e manutenção de possíveis fatores de virulência que contribuem para emergência de epidemias. Inicialmente, desafiamos culturas de A. castellanii com amostras de fungos patogênicos e não-patogênicos, e determinamos a cinética de interação entre os fungos propostos e A. castellanii, onde houve aumento nas interações, dependendo do tempo e razão fungo: Acanthamoeba utilizados. Quando os fungos foram co-cultivados com ameba, somente Cryptococcus neoformans, Candida albicans e em menor proporção, Paracoccidioides brasiliensis, foram capazes de crescer, enquanto Sporothrix brasiliensis apresentou viabilidade inalterada e H. capsulatum e S. cerevisiae, foram mortos pela A. castellanii. Ao avaliar o crescimento fúngico no interior das Acanthamoebas, este organismo provocou a morte somente do H. capsulatum, enquanto os outros fungos foram capazes de manter-se viáveis no interior do seu fagossomo. A fim de avaliar a modificação da virulência fúngica em contato com a ameba, os fungos foram recuperados após crescimento em presença de A. castellanii, e utilizados para infectar o modelo in vivo de Galleria mellonella, onde observamos que todos os fungos foram capazes de matar mais rapidamente as larvas em comparação com fungos controles crescidos em meio somente. Com o objetivo de determinar as proteínas de A. castellanii responsáveis pelo reconhecimento fúngico, determinamos inicialmente o proteôma de A. castellanii, seguido sequencialmente, pela identificação das proteínas da superfície de A. castellanii capazes de ligação fúngicas, incluindo a participação de receptores de manose. Estas informações nos ajudaram a evidenciar o papel de novos hospedeiros fúngicos, como amebas, na manutenção da virulência fúngica e interação fungo com hospedeiros ambientais inferiores.According to the World Health Organization, about 3.4 million people die every year due to consumption of contaminated water, lack of sanitation and hygiene. Microbiological contamination of water has great contribution by free-living amoebae (FLAs). The FLAs are characterized by being very resistant to environmental adversities, as well as germicides. Therefore, they are excellent reservoirs for a variety of bacteria, viruses and fungi found in the environment, such as Legionella pneumophila, Mycobacterium sp., Escherichia coli and adenovirus. In the case of fungi spacifically, FLAs, Acanthamoeba castellanii has been described as potential environmental host for a wide variety of fungal pathogens causing fungal infections as Cryptococcus spp., Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitides, and Sporothrix schenkii. However, the mechanisms involved in this interaction are not fully elucidated. The aim of this work is to characterize molecularly the instances that enable FLAs to interact and harbor distinct fungal pathogens, leading to selection and maintenance of possible virulence factors that contribute to emerging epidemics. Initially, cultures of A. castellanii were challenged with samples of fungal pathogens and non-pathogens, to determine the kinetics of interaction between the proposed fungi and A. castellanii, where there was an increase in interaction depending on time and multiplicity of infection used. When these fungi were co-cultured with the amoeba, only Cryptococcus neoformans, Candida albicans and at lower proportion, Paracoccidioides. brasiliensis, were able to grow, while Sporothrix brasiliensis displayed unchanged viability, and H. capsulatum and S. cerevisiae were killed by A. castellanii. When we consider the fungal growth inside the Acanthamoebas, this organism was able to kill only the H. capsulatum, while other fungi were able to mantein their viability within its phagosome. In order to assess the modification of fungal virulence in contact with the amoeba, fungi were recovered after growth in the presence of A. castellanii, and used to infect the in vivo model of Galleria mellonella, where we observe that all the fungi were able to kill the larvae faster when compared to fungi grown in Acanthamoeba medium alone. In order to determine the A. castellanii proteins responsible for fungal recognition, initially we determine the proteome of A. castellanii, followed sequentially by the identification of the A. castellanii surface proteins capable of fungal binding, including the partpation among several proteins, of mannose receptors. This information helped us to highlight the role of new fungal hosts such as amoebas, the maintenance of fungal virulence and interaction fungus with lower environmental hosts