Immune mapping of five proteins from Leptospira interrogans for the development of specific IgM and IgG diagnostic tests

Trabalho desenvolvido no Laboratório de Bioquímica de Proteínas e Peptídeos Centro de Desenvolvimento Tecnológico em Saúde-FIOCRUZA notificação de casos de Leptospirose no mundo vem crescendo anualmente, entretanto no Brasil tem se mantido com cerca de 3.600 casos/ano e recrudesce quando existem catástrofes ambientais. Quando diagnosticada rapidamente pode ser tratada adequadamente, contudo o diagnóstico incorreto pode levar a lesões renais e hepáticas graves e ao óbito. A dificuldade diagnóstica laboratorial ocorre por falta de um teste específico e sensível. O teste diagnóstico ainda utilizado em muitos países é o de aglutinação microscópica (MAT) e pesquisa de Leptospira. Apesar destes testes não serem específicos e apresentarem baixa sensibilidade, ainda são recomendados e distribuídos pelo Ministério da Saúde no Brasil (MS/Brasil). Visando identificar estruturas antigênicas que possam contribuir para o desenvolvimento de testes de diagnósticos rápidos e específicos, os epitopos IgM e IgG de 5 proteínas de Leptospira interrogans (Lip32, Lip41, Lp49, ICD e Lpsinal) foram mapeadas, utilizando a técnica de microarranjo de peptídeos por Spot-synthesis. Um total de 112 epítopos majoritários foram identificados (54 IgM e 58 IgG) e destes 33 compartilhavam reatividade tanto IgM quanto IgG. Após eliminação dos epítopos que apresentaram reação cruzada, cinco epitopos (Lip32/05-M, Lip32/11-M, Lip41/02-M, Lip41/03-M, Lip41/06-M), considerados específicos por análise in silicos e reatores tanto para IgM quanto IgG foram selecionados. Uma análise por modelagem molecular, mostrou que estes epitopos estavam dispostos na superfície molecular, portanto acessíveis ao solvente. Dois destes epitopos foram selecionados e sintetizadas quimicamente (Lip32/05-M e Lip41/02-M) sob forma de peptídeos multiantigênicos (MAP4) e analisadas por ELISA com um painel de soros de pacientes saudáveis e com doenças não relacionadas. Os resultados da curva ROC, mostraram que os peptídeos apresentaram uma lata sensibilidade (100%) e especificidade (100%) com ótimo desempenho (p<0.05), indicando assim, que estes peptídeos são elegíveis para passarem para estudos de fase 2 de desenvolvimento de um teste diagnóstico específico para Leptosirose.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorConselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoFundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de JaneiroPró-Reitoria de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação - Universidade Federal FluminenseThe notification of Leptospirosis cases in the world has been growing annually, however, in Brazil, it has remained with about 3,600 cases/year and increases when there are environmental catastrophes. When diagnosed quickly it can be treated appropriately, however, the incorrect diagnosis can lead to severe kidney and liver damage and death. The laboratory diagnostic difficulty occurs due to the lack of a specific and sensitive test. The diagnostic test still used in many countries is microscopic agglutination (MAT) and Leptospira research. Although these tests are not specific and have low sensitivity, they are still recommended and distributed by the Ministry of Health in Brazil (MS / Brazil). To identify antigenic structures that may contribute to the development of rapid and specific diagnostic tests, the IgM and IgG epitopes of 5 Leptospira interrogans proteins (Lip32, Lip41, Lp49, ICD, and Lpsinal) were mapped, using the peptide microarray technique by Spot-synthesis. A total of 112 major epitopes were identified (54 IgM and 58 IgG) and of these 33 shared reactivity with both IgM and IgG. After eliminating the cross-reacting epitopes, five epitopes (Lip32/05-M, Lip32/11-M, Lip41/02-M, Lip41/03-M, Lip41/06-M), considered specific by in silico analysis and reactors for both IgM and IgG were selected. An analysis by molecular modeling showed that these epitopes were distributed on the molecular surface, therefore accessible to the solvent. Two of these epitopes were selected and chemically synthesized (LipL32 / 03-M and LipL41/02-M) in the form of multi-antigenic peptides (MAP4) and analyzed by ELISA with a panel including sera from healthy patients and with unrelated diseases. The results of the ROC curve showed that the peptides presents a high sensitivity (100%) and specificity (100%) with excellent performance (p