Influence of the muscle graft skeletons in the ear in a regeneration of muscle MDX mice

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) it is a fatal X-linked Xp21 locus inflammatory myopathy that affects 1 at 3500 male born neonates. Main clinical manifestation is muscular weakness, respiratory complications and evolution for death by the end of adolescence. Molecular alteration due to deletion and/or mutations in the dystrophin gene cause marked alteration in the cytoarchitecture of the muscular tissue. Dystrophin is a sarcolemmal protein that interacts with Factin in the sarcoplasm and laminin (LN) in the extracelular matrix. This promotes stabilization of the sarcolemma and protection against damage induced by the muscular contraction. Mdx mouse, a spontaneous mutant of the C57BL10/ScSn colony, is considered the appropriate animal model for studies of the physiopathology of DMD muscular lesion. Unlike the human homologous, mdx mice do not develop a fatal disease. Mdx mice show efficient regeneration and maintenance of muscular function throughout the life, though presenting characteristic phases with prevalence of myonecrosis, muscular regeneration and/or fibrosis. Experimental model of ectopic muscle grafting in the pina auricular allows detailed study of factors influencing cellular migration and inflammation in the implanted microenvironment and at distal sites. The aim of this study was to analyze the impact of grafting soleus muscle from C57 non dystrophic mice in the pina auricular of mdx mice in the microenvironment of the graft and the regeneration of skeletal muscles Triceps brachii (close site), Soleus and Gastrocnemius (distal site). Mdx mice at 6 weeks (w) received implant of 2w old Soleus muscle from C57 mice. Mdx mice, controls (C57/C57) and mdx mice submitted to surgical stress (sham) were sacrificed at 7, 10 and 15 days post grafting (dpe). The ears with implanted graft and also skeletal muscles (triceps, soleus and gastrocnemius) were processed for histology hematoxylin-eosin to assess morphological alterations. Tissues were also processed for imunohistochemistry to establish changes in the muscular microenvironment. It was used immunolabeling for Laminin (LN); NCAM positive cells for presence of satellite/activated myoblasts cells and hematopoietic stem cells (Sca-1+). Mdx 10dpe, showed increased expression of LN in the T.brachii (p <0,001), in the soleus (p <0,001) and gastrocnemius (p <0,01) skeletal muscles. Further increase of NCAM+ was also observed in skeletal muscles (T.brachii, Soleus) of mdx-Enx but not in the gastrocnemius muscles of mdx-Enx (15 dpe) and sham mdx mice. Likewise skeletal muscles of sham and mdx-Enx showed augment of Sca-1+ cells. Altogether the results indicate that implantation of ectopic syngeneic graft increased LN expression, proliferation and/or migration Sca-1+ cells into areas of muscular lesion further promoting muscle regeneration as assessed by increased numbers of NCAM positive cells in mdx muscles.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorDistrofia Muscular do tipo Duchenne (DMD) é uma miopatia inflamatória fatal ligada ao cromossomo X locus Xp21, que acomete cerca de 1 a cada 3500 neonatos do sexo masculino. A principal manifestação clínica é a fraqueza muscular precoce, deformidades musculares, complicações respiratórias e evolução para óbito ao final da adolescência. A alteração molecular, devido à deleção e/ou mutações no gene da distrofina acarreta defeitos na citoarquitetura do tecido muscular. Distrofina é uma proteína do citoesqueleto localizada abaixo do sarcolema, mediando interação entre a F-actina no sarcoplasma e laminina (LN) na matriz extracelular promovendo estabilização do sarcolema e proteção de danos induzidos pela contração muscular. O camundongo mdx, um mutante espontâneo da colônia de C57BL10/ScSn, é considerado o modelo animal mais adequado para o estudo da fisiopatologia da lesão muscular do tipo DMD. Contudo ao contrário do homólogo humano a mutação no mdx não determina uma doença fatal, ocorrendo regeneração eficiente e manutenção da funcionalidade do tecido muscular. O mdx apresenta fases com prevalência de mionecrose, regeneração muscular e resolução com reparo e cicatrização. O modelo de enxerto ectópico de músculo no pavilhão auricular possibilita o estudo detalhado de fatores que influenciam a migração celular e a inflamação no tecido implantado. Neste trabalho foi utilizado enxerto ectópico singênico de músculo solear na região dorsal do pavilhão auricular visando caracterizar o possível impacto na regeneração dos músculos tríceps (próximo ao enxerto) e do solear e gastrocnêmio, localizados de forma distal. Foram utilizados camundongos C57 e mdx machos com 2 e 6 semanas (s) Com 6 s de idade o mdx recebeu no pavilhão auricular, o implante de músculo solear de C57 de 2 s idade .As orelhas com os enxertos e os músculos tríceps, solear e gastrocnêmio do mdx e controles foram coletados para análise 7, 10 e 15 dias pós-enxerto (dpe). Para eliminar os possíveis efeitos do estresse nos resultados foi incluído grupo mdx sham submetido somente a cirurgia sem receber o enxerto. As orelhas com enxerto singênico (C57/C57), (C57/Mdx) e os músculos esqueléticos (gastrocnêmio, tríceps e solear) dos mdx com enxerto (Enx) foram processados, corados pela hematoxilina-eosina para caracterização do infiltrado celular e por imunohistoquimica para estudo do microambiente do músculo: expressão de laminina (LN), presença de células satélites (NCAM+) e células tronco hematopoiéticas (Sca-1+). Mdx 10dpe, apresentaram aumentos significativos na expressão de LN no tríceps(p<0,001), solear(p<0,001) e gastrocnêmio(p