Towards a deeper understanding of the pathophysiology of allergic diseases

La prevalencia de enfermedades alérgicas ha crecido notablemente a lo largo de las últimas décadas, afectando negativamente a la calidad de vida de los pacientes, así como incrementando los costes médicos de los sistemas públicos de salud. La inmunoterapia hiposensibilizante (AIT) es el tratamiento más prometedor de cara a poder erradicar completamente estas enfermedades, pero su uso todavía no está extendido debido a los bajos ratios beneficio/riesgo que presentan las formulaciones actuales. Por tanto, desarrollar nuevas AIT y mejorar sus protocolos de administración resulta vital. Debido a esto, el primer objetivo de esta tesis ha consistido en estudiar los mecanismos de sensibilización a alérgenos respiratorios, tomando Alt a 1 (el alérgeno mayor de Alternaria alternata) como modelo. Mediante el uso de ratones de experimentación, se ha demostrado que Alt a 1 no necesita adyuvantes para promover fenotipos alérgicos in vivo. En su lugar, es capaz de unirse a receptores TLR4 presentes en células con un fenotipo similar al de los macrófagos alveolares. Esto podría estar relacionado con su capacidad para activar la ruta proinflamatoria NF-κB y la señalización a través del inflamasoma (↑ caspasa-1 bioactiva), lo que promovería la infiltración a nivel pulmonar de diferentes células del sistema inmune (Siglec-F+, F4/80+ y CD3+, respectivamente). En conjunto, todo ello permite la sensibilización del individuo y la producción de anticuerpos frente al alérgeno. El segundo objetivo de esta tesis ha sido profundizar en nuestro conocimiento del proceso de sensibilización alérgica a los alimentos, tomando como modelo la sensibilización a Pru p 3 (alérgeno mayor del melocotón) a través de la piel. Con ello se ha demostrado que la exposición constante a cremas depilatorias provoca a largo plazo un primado de la ruta NLRP3 in vivo, y que esta ruta es fundamental para promover la sensibilización a Pru p 3. A mayores, la exposición al alérgeno (pero no la depilación) promueven el remodelado de la piel, así como la infiltración de células CD45+ no solo en el área sensibilizada (la piel), sino a lo largo de diferentes tejidos (pulmones e intestinos), sistematizando de este modo la respuesta. Finalmente, se ha estudiado la habilidad de partículas similares a virus (VLPs) derivadas del virus del mosaico del nabo (TuMV) como plataformas para ser usadas en el tratamiento de las alergias, usando la alergia a Pru p 3 como modelo. La caracterización inicial de la fórmula (VLP-Pru p 3 con su ligando lípido, esto es, VLP-Complex) confirmó su capacidad para inducir la proliferación de células inmunológicas humanas in vitro. Además, la fórmula fue transportada por células epiteliales intestinales, sin afectar negativamente a la integridad de la barrera. Finalmente, la administración sublingual de VLP-Complex fue capaz de reducir algunos marcadores serológicos asociados con respuestas alérgicas en ratones sensibilizados a Pru p 3, mejorando también la infiltración de células CD45+ en la piel de los mismos especímenes. Estos resultados no se acompañaron de efectos secundarios detectables a nivel macroscópico, nefrítico o hepático. En resumen, los resultados presentados en esta tesis permiten profundizar en el conocimiento de los mecanismos moleculares de la sensibilización a Alt a 1 y Pru p 3. Asimismo, presentan una nueva formulación (VLP-Complex) candidata a ser estudiada en el futuro como AIT para el tratamiento de la alergia a Pru p 3. ABSTRACT The prevalence of allergic diseases has constantly risen over the last decades, significantly impacting the quality of life of the patients, and increasing medical costs of public healthcare economies. Allergen-specific immunotherapy (AIT) is the most promising treatment that can reverse the allergic phenotype of an individual, but its use is not extended because of insufficient benefit/risk ratios of current formulations. Developing new AIT strategies and improving administration protocols is vital to overcome the problems associated with allergic diseases. In light of the above, the first objective of this thesis was to study allergic sensitization to airborne allergens, using Alt a 1 (Alternaria alternata’s major allergen) as a model. Using a murine model of the pathology, we demonstrated that Alt a 1 does not need of an exogenous adjuvant to promote allergic sensitization in vivo. Instead, it is able to bind to TLR4 molecules in alveolar macrophage-like cells present in healthy lungs. This might be related with its ability to activate downstream NF-κB and inflammasome (↑ bioactive caspase-1) signaling, which subsequently promote the infiltration of the lung with cells from immune origin (Siglec-F+, F4/80+ and CD3+ cells, respectively), to promote sensitizing responses and antibody production. The second objective of this thesis has been to deepen our knowledge regarding allergic sensitization to food, using epicutaneous sensitization to Pru p 3 (peach’s major allergen) as a model. By studying the effects of long-term continued depilation on the skin, we have proven that it leads to priming of the NLRP3 pathway in vivo, and that this route is vital to promote sensitization to Pru p 3. In addition, allergen encounter (but not depilation) promoted skin remodeling, as well as CD45+ infiltration not only in the sensitized area (the skin), but across several mucosal tissues (lungs and gut), furtherly validating the systemization of the response. Finally, we studied the ability of virus-like particles (VLPs) derived from Turnip mosaic virus (TuMV) as presenting platforms to be used in the treatment of allergic pathologies, using allergy to Pru p 3 as a model. Initial in vitro characterization of the formula (VLP-Pru p 3 with its associated lipid ligand, i.e., VLP-Complex) confirmed that it was able to induce proliferation of human immune cells. In addition, VLP-Complex was also able to be transported by intestinal epithelial cells, without affecting the monolayer integrity. Finally, sublingual administration of VLP-Complex could effectively reduce some serological markers associated with allergic responses in Pru p 3-sensitized mice, as well as CD45+ infiltration in the skin. Noteworthy, no associated macroscopic, nephritic, or hepatic toxicity was detected, as assessed by weight, blood urea nitrogen (BUN) and galectin-3 analyses, respectively. To sum up, the results presented in this thesis have helped to increase our knowledge regarding how sensitization to Alt a 1 and Pru p 3 works. In addition, it presents a new putative AIT formulation (VLP-Complex), that can be studied and furtherly optimized to treat Pru p 3 allergy in a future