The endocannabinoid system as a therapeutic target for retinopathies

Introduction: Diabetic Retinopathy (DR) is one of the major complications of diabetes mellitus. It is characterized by microvascular disruption, the presence of inflammation and progressive degeneration of neuronal cells, which collectively lead to attenuation of optical acuity and eventually bnindness. The major event that leads to the manifestation of DR is the disruption of the “neurovascular unit” (NVU) homeostasis, a term used to describe the functional interaction and interdependency among neural, glial cells and blood vessels in the retina. Chronic hyperglycemia reduces expression of protective neurotrophic factors and favors an increase in the expression of pro-inflammatory mediators, such as cytokines and vascular endothelial growth factor (VEGF). This imbalance contributes to the progressive loss of endothelial cells, the tight junctions of which form the inner blood retina barrier (iBRB). As a result, there is an increase in vascular permeability which allows cytotoxic factors enter the retina and induce the development of inflammation and oxidative stress. This is also accompanied by the progressive degeneration of neural cells, through the activation of apoptotic pathways. Furthermore, due to the drastic changes in retina physiology at the early stages of DR, glial cells become activated and prarticipate and mediate pro-inflammatory responses. The earlier tenet that DR is only a microvascular complication has been revised, with studies examining the critical contribution of neurodegeneration in the pathophysiology of DR. A growing body of evidence suggests that oxidative stress, neurodegeneration and inflammation are present at the early stage of the disease, even before the development of the microvascular complications. Current treatments for DR (laser, intravitreal injection of antiVEGF agents and corticosteroids) are applied during the advance stage of the disease, where patient’s vision is already compromised. These treatments mainly focus on the treatment of vasculopathy and inflammation. Therapeutic intervention at the early stage of DR is only limited in the tight control of risk factors for the development of the disease, such as blood glucose and blood pressure. Finding and implementing new treatments with neuroprotective and anti-inflammatory properties at the early stage of DR is imperative, since this could be a good strategy for intercepting the development of the disease towards the vision threatening advance stage. The endocannabinoid system (ECS) has a neuromodulatory role in the central nervous system (CNS), as it controls the activation of voltage gated ion channels, the presynaptic release of glutamate and the activation of pro-survival cell signaling pathways. In retina CB1 receptors are expressed in various neuronal cell populations, like photoreceptors, amacrine and ganglion cells. CB2 receptors are mainly located in glial cells, where they participate in the regulation of inflammatory responses. Numerous studies have reported the neuroprotective properties of the ECS in the CNS. In the retina the neuroprotective properties, mediated by CB1 receptor activation, are also well described in various models of retinopathies. However extensive data indicate that in diabetic complications, other than DR, CB1 receptor activation promotes oxidative stress and inflammation, while the use of CB1R antagonists reduces cell death, inflammation and vascular damage. The protective properties, mediated by inhibition of CB1 receptor activity, have also been confirmed in neurodegenerative conditions in the ocular system. In contrast to CB1 receptor activation, CB2 receptor activation displays neuroprotective effects, since it reduces inflammation, oxidative stress and cell death. The protective properties of CB2 agonists have also been evaluated in diabetic complications, such as diabetic nephropathy and also in neurodegenerative diseases in brain and retina. Numerous studies have confirmed the neuroprotective properties of cannabinoid receptors [15]agonists in various retinopathies, including excitotoxicity models. Apart from direct cannabinoid agonists, inhibition of the metabolic enzymes of endocannabinoids seems to be an effective strategy for indirectly controlling signaling through cannabinoid receptors. Although numerous reports in the brain have confirmed the neuroprotective action of the inhibitors of the endocannabinoids metabolism, the data in the retina are limited. Aim of the study: The goal of the present thesis was the study of the neuroprotective properties of the ECS in two in vivo animal model of retinopathy: A. In the first part, an in vivo two week, streptozotocin (STZ) induced model of DR, which resembles the phenotype observed at the early stages of the disease, was employed for the study of the neuroprotective, anti-inflammatory and vasculoprotective actions of the eyedrop administration of a) SR141716 (CB1 antagonist), b) AM1710 (CB2 agonist) and c) their combination (SR141716+AM1710). B. In the second part we employed an in vivo model of AMPA induced retinal excitotoxicity, in order to study the neuroprotective and anti-inflammatory actions of two novel inhibitors of 2-AG hydrolytic enzymes: a) AM12100 [alpha/betaHydrolase domain containing 6 (ABHD6) inhibitor] and b) AM11920 [dual alpha/betaHydrolase domain containing 6/ monoacylglycerol lipase (ABHD6/MAGL) inhibitor]. Methods: Male and female rats weighting 250-300 g were employed for all the experiments. For the DR study, diabetes was induced by a single intraperitoneal (i.p) injection of STZ (70 mg/kg). Animals with blood glucose levels >250 mg/dL were considered diabetic. Cannabinoids were administered daily as eyedrops for 14 days at a dosage of 10 mg/ml, starting two days post STZ injection. The experimental design was as following: 1. Control+vehicle, 2. Diabetic+vehicle, 3. Diabetic+AM1710, 4. Diabetic+SR141716 and 5. Diabtic+AM1710+SR141716. Twenty-four hours after the last eyedrop, animals were euthanized ant their retinas were collected. Imunnohistochemical studies with antibodies against NFL (neurofilament, ganglion cell axon marker), cleaved caspase 3 (apoptotic cell death marker) and bNOS (brain nitric oxide synthase, amacrine cell marker) were conducted for the estimation of neuroprotection. An antibody against NT (nitrotyrosine, nitrative/oxidative stress marker) was used for the study of the oxidative damage. Furthermore a histological stain with Eosin/Hematoxylin was employed in order to assess retina thickness. For the study of the anti-inflammatory actions of the cannabinoid treatment we used antibodies against GFAP (Glial fibrillary acidic protein, microglia marker) and Iba1 (Ionized calcium-binding adaptor molecule 1, microglia marker) and ELISA for TNFα(Tumor necrosis factor α). Finally, for the estimation of the vasculoprotective actions of cannabinoids we performed a colocalization study between CD-31 (cluster of differentiation 31, endothelial cell marker), ELISA for VEGF (Vascular endothelial growth factor A) and Evans Blue (EB) assay (assessment of vascular leakage). For the AMPA excitotoxicity experiments animals received intravitreal injections of AMPA (42 nmol/ eye), either alone or in combination with AM12100 (10-5-10-3 M) or AM11920 (10-6-10-4 M). Twenty-four hours after the injections, retinas were collected after euthanization of the animals. Cannabinoidmediated neuroprotection was assessed by an immunohistochemical study with an antibody against bNOS, while for the anti-inflammatory actions antibodies againt GFAP and Iba1 were employed. Results: Topical administration of cannabinoids via eyedrops displayed various protective astions in the DR model. The diabetes induced reduction in NFL-immunoreactivity (IR) thickness and intensity was blocked by AM1710, SR141716 and their combination. AM1710 and SR141716 also blocked the diabetes induced reduction in total retinal thickness and [16]especially in the inner nuclear layer (INL). Only AM1710 inhibited apoptotic cell death in the INL. AM1710 and the dual treatment (SR141716+AM1710) protected bNOS+cells in the INL. All of the three cannabinoid treatmens effectively attenuated nitrative damage in the diabetic rat retina. AM1710 was the only cannabinoid treatment that displayed significant anti-inflammatory actions, since it reduced microglia and microglia activation, as well as the levels of TNF-α. Single administration of AM1710 and SR141716 attenuated vascular leakage and the levels of VEGF in the retina. In the AMPA excitotoxixity model, the manipulation of endogenous 2-AG levels by the use of inhibitors of its hydrolytic enzymes displayed protective properties, too. AM12100 (ABHD6 inhibitor) and AM11920 (dual ABHD6/MAGL inhibitor) provided protection against AMPA in a dose dependent manner, with the greatest efficacy observed after administration of the dual inhibitor. Both inhibitors also mediated significant anti-inflammatory actions, by attenuating macroglia activation, but only the dual inhibitor, AM11920, reduced the number of reactive microglial cells in the retina. Conclusions: The employment of CB2 agonists and CB1 antgonists at the early stages of DR, may be a beneficial therapeutic strategy for attenuating the early pathophysiological symptoms and intercepting disease progression towards the vision threatening, advanced stages. The manipulation of endogenous cannabinoid levels with the use of inhibitors of 2-AG metabolism seems to be an alternative method for attenuating neurodegeneration and inflammation induced by excitotoxicity, which in fact possesses several advantages over the use of direct cannabinoid agonists. Collectively, data from the present study suggest that ECS represents a promising target for the treatment of retinopathies. However, more studies are needed in order to study the exact mechanism via which cannabinoids exert their protective properties and eliminate any limitations resulting from the use of cannabinoids as therapeutic agents.Εισαγωγή: Η διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια (ΔΑ), αποτελεί μία από τις κυριότερες επιπλοκές του διαβήτη και χαρακτηρίζεται από εκτεταμένες βλάβες στα αγγεία του αμφιβληστροειδούς, την παρουσία φλεγμονής και την προοδευτική εκφύλιση διαφόρων κυττάρων του αμφιβληστροειδούς, που οδηγεί σε μείωση της οπτικής οξύτητας και τύφλωση. Το βασικό γεγονός που οδηγεί στην εκδήλωση της ΔΑς, είναι η διαταραχή στην ομοιόσταση της «νευροαγγειακής μονάδας» (neurovascular unit) στον αμφιβληστροειδή, ένας όρος που χρησιμοποιείται για να περιγράψει την στενή λειτουργική σύνδεση και αλληλεξάρτηση μεταξύ των νευρώνων, των γλοιακών κυττάρων και των αγγείων του αμφιβληστροειδούς. Η χρόνια υπεργλυκαιμία στον διαβήτη, μειώνει την έκφραση προστατευτικών νευροτροφικών παραγόντων και αυξάνει την έκφραση προφλεγμονωδών παραγόντων, όπως οι κυτοκίνες και ο αυξητικός παράγοντας των ενδοθηλιακών κυττάρων (VEGF). Αυτή η ανισορροπία συμβάλει στην προοδευτική καταστροφή των ενδοθηλιακών κυττάρων, που απαρτίζουν τα τοιχώματα των αγγείων και συνθέτουν τον εσωτερικό αιματο-αμφιβληστροειδικό φραγμό (ΑΑΦ), με αποτέλεσμα την αύξηση της διαπερατότητας των αγγείων και την είσοδο στοναμφιβληστροειδή κυτταροτοξικών παραγόντων, που οδηγούν στην εκδήλωση φλεγμονής, ισχαιμίας και οξειδωτικού στρες. Παράλληλα παρατηρείται προοδευτική εκφύλιση των νευρικών κυττάρων του αμφιβληστροειδούς, μέσω αποπτωτικών μηχανισμών. Εξαιτίας των εκτεταμένων αλλαγών που συμβαίνουν κατά τα πρώιμα στάδια της ΔΑς, παρατηρείται και το φαινόμενο της αντιδραστικής γλοίωσης, κατά το οποίο τα μικρογλοιακά κύτταρα, τα αστροκύτταρα και τα κύτταρα του Muller ενεργοποιούνται και ενδέχεται να διαμεσολαβήσουν προφλεγμονώδεις αποκρίσεις, ενισχύοντας κατ’ αυτόν τον τρόπο την νευρο-φλεγμονή. Η παλαιότερη άποψη που θεωρούσε την διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια απλά μία μικρο-αγγειακή διαταραχή, έχει αναθεωρηθεί, καθ’ ότι πλέον οι μελέτες, λαμβάνουν σοβαρά υπόψη τους και την συνεισφορά της νευροεκφύλισης στην παθοφυσιολογία της νόσου. Ολοένα και περισσότερες ενδείξεις, υποδεικνύουν ότι το οξειδωτικό στρες, η νευροεκφύλιση και η φλεγμονή εκδηλώνονται κατά τα πρώιμα στάδια της νόσου και σε συγκεκριμένες περιπτώσεις προηγούνται των διαταραχών στα αγγεία. Οι υπάρχουσες θεραπείες για την ΔΑ (λέιζερ, ενδοφθάλμια έγχυση παραγόντων που αναστέλλουν τον VEGF και τα κορτικοστεροειδή), εφαρμόζονται σε μεταγενέστερα στάδια της νόσου, όπου η όραση του ασθενούς έχει πλέον υποστεί μεγάλη βλάβη, ενώ στοχεύουν κυρίως την αγγειακή συνιστώσα της νόσου και δευτερευόντως την φλεγμονή. Κατά τα αρχικά στάδια της νόσου, οι όποιες παρεμβάσεις περιορίζονται απλά στον έλεγχο των παραγόντων κινδύνου για την νόσο, όπως τα επίπεδα γλυκόζης και η υπέρταση. Η ανάγκη για την εύρεση φαρμακευτικών παραγόντων με νευροπροστατευτικές και αντιφλεγμονώδεις δράσεις και η εφαρμογή τους κατά τα αρχικά στάδια γένεσης της ΔΑς είναι επιτακτική, καθ’ ότι θα μπορούσε να αποτελέσει μια καλή θεραπευτική στρατηγική για την αντιμετώπιση της εξέλιξης της νόσου. To ΕΚΣ διαθέτει το ρόλο του νευρορρυθμιστή στο κεντρικό νευρικό σύστημα, καθώς είναι σε θέση να ελέγχει τασεοελεγχόμενους διαύλους ιόντων, την προσυναπτική απελευθέρωση του γλουταμινικού οξέος και την ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών, που συμμετέχουν σε σημαντικές κυτταρικές αποκρίσεις, όπως η επιβίωση ή η διαφοροποίηση του κυττάρου. Στον αμφιβληστροειδή, οι CB1 υποδοχείς εκφράζονται σε διάφορους τύπους νευρικών κυττάρων, όπως οι φωτοϋποδοχείς, τα βραχύινα και τα γαγγλιακά κύτταρα. Oι CB2 υποδοχείς εκφράζονται κατά κύριο λόγο σε κύτταρα της γλοίας, όπως τα κύτταρα του Muller και η μικρογλοία, όπου διαδραματίζουν κομβικό ρόλο στην ρύθμιση των [11]φλεγμονωδών αποκρίσεων. Οι προστατευτικές επιδράσεις που επιδεικνύει το ΕΚΣ σε νευροεκφυλιστικές διαταραχές στο νευρικό σύστημα, έχουν μελετηθεί εκτενώς. Στον αμφιβληστροειδή μελέτες αναφέρουν τις νευροπροστατευτικές ιδιότητες των κανναβινοειδών, μέσω της ενεργοποίησης των CB1 υποδοχέων, σε αρκετά μοντέλα αμφιβληστροειδοπαθειών. Ωστόσο, ευρήματα από μελέτες σε μοντέλα επιπλοκών του διαβήτη, υποδεικνύουν, ότι η ενεργοποίηση του CB1 υποδοχέα ενισχύει το οξειδωτικό στρες και τη φλεγμονή, ενώ η χρήση ανταγωνιστών για τον CB1 υποδοχέα, μειώνει τον κυτταρικό θάνατο, το οξειδωτικό στρες, την φλεγμονή και παρουσιάζει αγγειοπροστατευτικές δράσεις, σε παθήσεις που σχετίζονται με το διαβήτη. Τα ευρήματα για τις προστατευτικές δράσεις που πρoκύπτουν από την αναστολή της ενεργοποίησης των CB1 υποδοχέων, αναφέρονται και σε νευροεκφυλιστικές διαταραχές στο οπτικό σύστημα. Εν αντιθέσει με τον CB1 υποδοχέα, η ενεργοποίηση του CB2 υποδοχέα των κανναβινοειδών, διαμεσολαβεί κατά κύριο λόγο προστατευτικές επιδράσεις, αφού είναι σε θέση να μειώνει την φλεγμονή, το οξειδωτικό στρες και τον κυτταρικό θάνατο. Οι προστατευτικές δράσεις των CB2 αγωνιστών έχουν επαληθευθεί σε μοντέλα επιπλοκών του διαβήτη, όπως η διαβητική νεφροπάθεια, καθώς και σε νευροεκφυλιστικές διαταραχές στον εγκέφαλο και τον αμφιβληστροειδή. Στον αντίποδα, πλήθος μελετών αναφέρουν τις νευροπροστατευτικές επιδράσεις αγωνιστών για τους κανναβινοειδικούς υποδοχείς (CB1/CB2) σε αρκετές αμφιβληστροειδοπάθειες και ειδικότερα σε μοντέλα διεγερσιτοξικότητας στον αμφιβληστροειδή. Πέραν των άμεσων αγωνιστών, η χορήγηση αναστολέων των μεταβολικών ενζύμων των ενδοκανναβινοειδών αποτελεί έναν έμμεσο τρόπο χειρισμού της σηματοδότησης τους μέσω των κανναβινοειδικών υποδοχέων. Παρά την πληθώρα ευρημάτων στον εγκέφαλο, στον αμφιβληστροειδή, τα ευρήματα για τις δράσεις των αναστολέων των ενζύμων μεταβολισμού των ενδοκανναβινοειδών είναι ελάχιστα. Στόχος: Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω, στόχος της συγκεκριμένης διατριβής είναι η μελέτη των προστατευτικών ιδιοτήτων των κανναβινοειδών σε δύο μοντέλα αμφιβληστροειδοπαθειών και για τον σκοπό αυτό χωρίστηκε σε δύο μέρη: Α. Στο πρώτο μέρος χρησιμοποιήθηκε ένα in vivo μοντέλο δύο εβδομάδων, επαγόμενης από στρεπτοζoτοκίνη ΔΑς σε επίμυες, το οποίο προσομοιάζει στα πρώιμα στάδια της νόσου και εξετάστηκαν οι νευροπροστατευτικές, οι αντιφλεγμονώδεις και οι αγγειοπροστατευτικές δράσεις, της χορήγησης τοπικά μέσω σταγόνων: α) SR141716, ανταγωνιστή του CB1 υποδοχέα, β) ΑΜ1710, αγωνιστή του CB2 υποδοχέα και γ) συνδυασμού των παραπάνω, SR141716+AM1710. Β. Στο δεύτερο μέρος χρησιμοποιήθηκε ένα in vivo μοντέλοδιεγερσιτοξικότητας επαγόμενης από AMPA στον αμφιβληστροειδή επίμυων. Εξετάστηκαν οι νευροπροστατευτικές και αντιφλεγμονώδεις δράσεις της ενδοϋαλοειδικής χορήγησης των ακόλουθων αναστολέων των μεταβολικών ενζύμων του ενδοκανναβινοειδούς 2-AG: α) AM12100 [αναστολέας της alpha/beta-Hydrolase domain containing 6 (ABHD6)] and b) AM11920 [διπλός αναστολέας της alpha/beta-Hydrolase domain containing 6/ monoacylglycerol lipase (ABHD6/MAGL)]. Μεθοδολογία: Σε όλα τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν αρσενικοί και θηλυκοι SpragueDawley επίμυες (250-300 g). Για τα πειράματα της ΔΑ, η επαγωγή του διαβήτη πραγματοποιήθηκε με μία ενδοπεριτοναϊκή (i.p) χορήγηση στρεπτοζοτοκίνης (STZ) (70mg/kg). Τα πειραματόζωα των οποίων η γλυκόζη ήταν >250 mg/dL θεωρούνταν διαβητικά. Τα προς μελέτη κανναβινοειδή χορηγήθηκαν καθημερινά για 14 ημέρες με την μορφή οφθαλμικών σταγόνων σε δοσολογία 10 mg/ml, ξεκινώντας δύο ημέρες μετά την χορήγηση του STZ. Σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό που εφαρμόστηκε προέκυψαν [12]οι ακόλουθες ομάδες: 1. Ομάδα ελέγχου+ έκδοχο, 2.Διαβητικά+ έκδοχο, 3. Διαβητικά+ AM1710, 4. Διαβητικά+ SR141716, 5. Διαβητικά+ AM1710+SR141716. Μία ημέρα μετά την τελευταία χορήγηση των κανναβινοειδών τα πειραματόζωα θανατώθηκαν, οι οφθαλμοί τους αφαιρέθηκαν και απομονώθηκε ο αμφιβληστροειδής. Για την εκτίμηση της νευροπροστασίας πραγματοποιήθηκαν ανοσοϊστοχημικές μελέτες έναντι του NFL(neurofilament, δείκτης αξόνων των γαγγλιακών κυττάρων), της cleaved caspase 3 (δείκτης αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου), της bNOS (brain nitric oxide synthase, δείκτης βραχύινων κυττάρων) και του NT (nitrotyrosine, δείκτης οξειδωτικής βλάβης). Επιπλέον εκτιμήθηκε το πάχος του αμφιβληστροειδούς με την χρήση της ιστολογικής χρώσης Ηωσίνης/ Αιματοξυλίνης. Οι αντιφλεγμονώδεις δράσεις των κανναβινοειδών αξιολογήθηκαν με την χρήση αντισωμάτων έναντι της GFAP (Glial fibrillary acidic protein, δείκτης αστροκυττάρων και κυττάρων του Muller), της Iba1 (Ionized calcium-binding adaptor molecule 1, δείκτης μικρογλοίας) και την πραγματοποίηση ELISA για την προφλεγμονώδη κυτοκίνη TNFα (Tumor necrosis factor alpha). Για την αξιολόγηση των αγειοπροστατευτικών δράσεων των κανναβινοειδών πραγματοποιήθηκε μελέτη συνεντοπισμού του NT με τον αγγειακό δείκτη CD-31 (cluster of differentiation 31, δείκτης ενδοθηλιακών κυττάρων), καθώς και ELISA για τον VEGF (Vascular endothelial growth factor A). Επιπροσθέτως για την εκτίμηση της αγγειακής διαπερατότητας χρησιμοποιήθηκε η τεχνική Evans Blue. Για τα πειράματα της AMPA διεγερσιτοξικότητας τα ζώα έλαβαν ενδοϋαλοειδικές εγχύσεις του AMPA (42 nmol/οφθαλμό) είτε μόνου του, είτε σε συνδυασμό με το AM12100 (10-5-10-3 M) ή το AM11920 (10-6-10-4 M). Μία ημέρα μετά την πραγματοποίηση των εγχύσεων τα πειραματόζωα θανατώθηκαν και αφαιρέθηκαν οι ιστοί τους. Η νευροπροστασία αξιολογήθηκε με την χρήση αντισώματος έναντι της bNOS, ενώ για τις αντιφλεγμονώδεις δράσεις, χρησιμοποιήθηκαν οι δείκτες των γλοιακών κυττάρων GFAP και Iba1. Αποτελέσματα: Στο μοντέλο της διαβητικής αμφιβληστροειδοπάθειας η θεραπεία με τα κανναβινοειδικά ανάλογα επέδειξε ποικίλες νευροπροστατευτικές αποκρίσεις. Αναλυτικότερα η επαγόμενη από τον διαβήτη μείωση του πάχους και της ανοσοδραστικότητας του NFL, αποκαταστάθηκε από την χορήγηση του AM1710, του SR141716 και του συνδυασμού τους. Επιπλέον τόσο το AM1710, όσο και το SR141716 αποκατέστησαν το μειωμένο πάχος του αμφιβληστροειδούς και ειδικότερα της INL. Ωστόσο, μόνο ο CB2 αγωνιστής, AM1710, ανέστειλε αποτελεσματικά τον αυξημένο αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο στην εσωτερική πυρηνική στιβάδα (INL). Το AM1710 και η συνδυαστική θεραπεία (AM1710+SR141716) προστάτευσαν επαρκώς τα βραχύινα κύτταρα που εκφράζουν b NOS, στην INL, χωρίς να παρατηρηθεί κάποια σημαντική επίδραση από τηνμεμονωμένη χορήγηση του SR141716. Ακόμη, oι τρεις κανναβινοειδικές θεραπείες ανέστειλαν τα αυξημένα επίπεδα της νιτροτυροσίνης (NT) στους διαβητικούς αμφιβληστροειδείς, με την μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα να επιτυγχάνεται από την συνδυαστική θεραπεία AM1710+SR141716. Σε επίπεδο φλεγμονής μόνο o CB2 αγωνιστής, AM1710, ήταν αποτελεσματικός. Ειδικότερα, το AM1710 μείωσε την αντιδραστικήμακρογλοία, τον αριθμό των ενεργοποιημένων μικρογλοιακών κυττάρων, καθώς και τα επίπεδα της προφλεγμονώδους κυτοκίνης TNFα στον αμφιβληστροειδή. Τα κανναβινοειδικά ανάλογα διαμεσολάβησαν επίσης και αγγειοπροστατευτικές δράσεις. Τόσο το AM1710 όσο και το SR141716, μείωσαν τα επίπεδα του VEGF και την αυξημένη αγγειακή διαρροή στον αμφιβληστροειδή των διαβητικών ζώων. Στο μοντέλο της AMPA διεγερσιτοξικότητας Το χειρισμός των ενδογενών επιπέδων της 2-AG εξυπηρετεί νευροπροστατευτικές δράσεις. Πιο συγκεκριμένα ο αναστολέας της ABHD6 (AM12100) και ο διπλός αναστολέας της ABHD6/MAGL (AM11920), προστάτευσαν τα bNOS κύτταρα με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, [13]με την μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα να παρατηρείται κατά την χορήγηση του διπλού αναστολέα, ΑΜ11920. Τέλος κατά την χορήγηση των αναστολέων προέκυψαν και αντιφλεγμονώδεις δράσεις. Ο διπλός αναστολέας της ABHD6/MAGL (AM11920), μείωσε τον αυξημένο αριθμό των ενεργοποιημένων μικρογλοιακών κυττάρων στον αμφιβληστροειδή, ενώ και οι δύο αναστολείς (AM12100 & AM11920) παρουσίασανδοσοεξαρτώμενη επίδραση στην μείωση της ενεργοποίησης της μακρογλοίας, χωρίς να διαφέρουν ως προς την αποτελεσματικότητά τους. Συμπεράσματα: Συμπερασματικά, γίνεται κατανοητό ότι η ενεργοποίηση του CB2 υποδοχέακατά τα πρώιμα στάδια της ΔΑς, θα μπορούσε να αποτελέσει μια καλή στρατηγική για την αναχαίτιση της ανεξέλεγκτης εξέλιξης της παθοφυσιολογίας της νόσου. Επιπλέον, πέρα από τους άμεσους αγωνιστές, ο χειρισμός