Rôle de l'histone désacétylase HDAC6 au cours de l'érythropoïèse humaine

Histone deacetylases (HDACs) are enzymes that remove the acetyl group from lysine residues of histone and non-histone proteins. Histone deacetylase 6 (HDAC6) is a member of the HDAC class IIb and deacetylates mainly cytoplasmic proteins such as tubulin, the chaperone protein HSP90 and cortactin. Several phase I and II clinical studies have shown that anemia frequently occurs in patients treated with a new class of anticancer HDAC6 inhibitors such as ricolinostat (ACY-1215). Yet, the role of HDAC6 in human erythropoiesis remains poorly understood. The objective of our study is to identify the role of HDAC6 in erythrocyte differentiation and thus to identify the underlying mechanism of anemia induced by HDAC6 specific inhibitors. To investigate this role, we used an in vitro erythrocyte differentiation model that produces more than 80% of reticulocytes after 20 days of culture from CD34+ hematopoietic stem cells (i), as well as the UT7/EPO erythroleukemic cell line, a model of EPO-dependent cell proliferation (ii). We examined how HDAC6 inhibition affects erythroid cells using a specific pharmacological inhibitor of HDAC6 (ACY-1215) and a specific lentiviral shRNA vector knockdown strategy. We show that HDAC6 was expressed and localized in the cytoplasm of erythroid cells during human erythropoiesis in vitro and that its inhibition with ACY-1215 blocked terminal erythroid differentiation. Furthermore, the delay in erythroid maturation occurred at the transcriptomic level and was associated with a global change in the erythroid cell transcriptome. HDAC6 knockdown by shRNA in UT7/EPO cells repressed erythroid differentiation at the transcriptional level and inhibited JAK2 phosphorylation in response to EPO. In addition, our biochemical studies reported that inhibition of HDAC6 enhanced JAK2/LNK interactions over LNK/14-3-3 zeta interactions while inducing increased acetylation of 14-3-3 zeta. In shHDAC6 transduced UT7/EPO cells, expressing a non-acetylable mutated form of 14-3-3 zeta partially recovered glycophorin A (GPA) expression. Taken together, our results identify for the first time a role for HDAC6 in monitoring JAK2/LNK interactions within human erythroid cells via regulation of the acetylation status of 14-3-3 zeta and this mechanism likely underlies the anemia occurring upon treatment with an HDAC6-specific inhibitorLes histone désacétylase (HDAC) sont des enzymes capables de retirer le groupement acétyle des résidus lysine des histones et des protéines non-histones. Membre de la classe IIb des HDAC, l'histone désacétylase 6 (HDAC6) désacétyle principalement des protéines cytoplasmiques telles que la tubuline, la protéine chaperonne HSP90 et la cortactine. Plusieurs travaux cliniques de phase I et II ont montré la survenue fréquente de l'anémie chez des patients traités avec une nouvelle classe d'agents anticancéreux qui inhibent spécifiquement HDAC6 tel que le ricolinostat (ACY-1215). Or le rôle d'HDAC6 dans l'érythropoïèse humaine reste peu compris jusqu'à présent. Dans notre étude, nous avons pour objectif d'identifier le rôle d'HDAC6 dans la différenciation érythrocytaire et ainsi de mettre en évidence le mécanisme responsable de l'anémie induite par les inhibiteurs spécifiques de cette enzyme. Afin d'étudier ce rôle, nous avons travaillé sur un modèle de différenciation érythrocytaire in vitro qui permet l'obtention de plus de 80% de réticulocytes après 20 jours de culture à partir de cellules souches hématopoïétiques CD34+ (i), ainsi que sur la lignée cellulaire érythroleucémique UT7/EPO, modèle de prolifération cellulaire EPO-dépendante (ii). Nous avons étudié les conséquences de l'inhibition d'HDAC6 sur les cellules érythroïdes en utilisant un inhibiteur pharmacologique spécifique d'HDAC6 (ACY-1215) et une stratégie de knock-down spécifique par vecteurs lentiviraux shRNA. Nous montrons qu'HDAC6 est exprimée et localisée dans le cytoplasme des cellules érythroïdes au cours de l'érythropoïèse humaine in vitro et que son inhibition avec ACY-1215 bloque la différentiation érythroïde terminale. De plus, le retard de maturation érythroïde se produit au niveau transcriptomique et est associé à une modification globale du transcriptome des cellules érythroïdes. Le knockdown d'HDAC6 par shRNA dans les cellules UT7/EPO a réprimé la différenciation érythroïde au niveau transcriptionnel et inhibé la phosphorylation de JAK2 en réponse à l'EPO. Par ailleurs, nos études biochimiques indiquent qu'une inhibition d'HDAC6 favorise les interactions JAK2/LNK au détriment des interactions LNK/14-3-3 zeta; tout en induisant une augmentation de la forme acétylée de 14-3-3 zeta. Dans les cellules UT7/EPO transduites shHDAC6, l'expression de la forme mutée non acétylable de 14-3-3 zeta a permis de rétablir partiellement l'expression de la glycophorine A (GPA). Ensemble, nos résultats identifient pour la première fois un rôle d'HDAC6 dans le contrôle des interactions JAK2/LNK au sein des cellules érythroïdes humaines via la régulation du statut d'acétylation de 14-3-3 zeta; et ce mécanisme est probablement à l'origine de l'anémie observée au cours d'un traitement par un inhibiteur spécifique d'HDAC