Étude de l’interaction d’enzymes mitochondriales impliquées dans le métabolisme du pyrroline-5-carboxylate chez Arabidopsis thaliana

The proteinogenic amino acid proline plays a crucial role for cellular metabolism in living organisms. In mitochondria, proline is oxidized to glutamate by the sequential action of proline dehydrogenase (ProDH) and pyrroline-5-carboxylate (P5C) dehydrogenase (P5CDH). In addition, ornithine δ-aminotransferase (δOAT) also participates in P5C formation through the conversion of ornithine and α-ketoglutarate into glutamate and P5C. Using mutants and biochemical approaches, ProDH1, P5CDH and δOAT were shown to be involved during dark-induced leaf senescence (DIS) in Arabidopsis thaliana. Striking accumulation of P5C and proline was observed in p5cdh mutant and to a lesser extent in prodh1prodh2 mutant, suggesting a putative proline-P5C cycle. Metabolomic analysis indicated that prodh1prodh2 and p5cdh have a similar metabolomic profile, but significantly different from wild-type and oat mutant, demonstrating the role of proline oxidation during DIS. ProDH1 was shown to be preferentially associated to the mitochondrial membrane fraction, while P5CDH and δOAT are more evenly distributed between matrix and membrane fractions. Homo- and hetero-oligomerizations of ProDH1, P5CDH, and δOAT were revealed using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) assay of infiltrated tobacco leaves. Interactions between P5C metabolism enzymes were further highlighted in DIS leaves using proteomics approaches coupled with mass spectrometry. Our work demonstrates that these three enzymes form P5C metabolic complex(es) involved in the oxidation of proline to fuel mitochondrial electron transfer chain to support the energy needs of senescent cells.La proline, acide aminé protéinogène, joue un rôle crucial dans le métabolisme cellulaire. Dans les mitochondries, la proline est oxydée en glutamate par l'action séquentielle de la proline déshydrogénase (ProDH) et de la pyrroline-5-carboxylate (P5C) déshydrogénase (P5CDH). L'ornithine-δ-aminotransférase (δOAT) participe également à la formation de P5C via la conversion de l'ornithine et de l’α -cétoglutarate en glutamate et P5C. L’utilisation de mutants et d’approches biochimiques a révélé que ProDH1, P5CDH et δOAT sont impliquées dans la sénescence des feuilles induite à l'obscurité (DIS) chez Arabidopsis thaliana. Une accumulation importante de P5C et de proline est observée chez le mutant p5cdh et, dans une moindre mesure chez le mutant prodh1prodh2, suggérant un cycle proline-P5C. Les mutants prodh1prodh2 et p5cdh ont un profil métabolomique similaire qui diffère de celui du WT et de oat, démontrant ainsi le rôle de l'oxydation de la proline au cours de la sénescence. Nous avons montré que ProDH1 est essentiellement associée à la membrane mitochondriale, tandis que P5CDH et δOAT sont plus uniformément réparties entre la matrice et la membrane. L’oligomérisation de ProDH1, P5CDH et δOAT a été révélée à l'aide d’une analyse de complémentation bimoléculaire de fluorescence (BiFC). Les interactions entre ces enzymes du métabolisme du P5C ont été confirmées par des approches de protéomique couplée à la MS en condition de sénescence chez A. thaliana. Ces trois enzymes forment un(des) complexe(s) impliqué(s) dans l'oxydation de la proline pour alimenter la chaîne de transfert d'électrons mitochondriale afin de pourvoir aux besoins énergétiques des cellules sénescentes