Understanding of new molecular bases during invasion through optogenetic manipulation of SRC and HCK signaling

L’invasion cellulaire est souvent médiée par la mise en place d’une famille de structures subcellulaires spécialisées, les invadosomes, régulées en partie par les membres de la familles SRC (dont HCK). Elles sont présentes dans les macrophages et réexprimées par les cellules métastatiques (Murphy, 2011). Ces structures couplent l'adhésion aux matrices extra-cellulaires et la dégradation de celles-ci (Destaing et al., 2014). Ainsi le travail de cette thèse s’est concentré sur la signalisation régulatrice des invadosomes dans différents contextes cellulaires. Une première étude nous a permis de mettre en évidence l’importance de la signalisation Ca2+-dépendante médiée par le canal calcique TRPV4. Nous avons démontré que ce canal était sensible aux espèce réactives de l’oxygène (ROS) induisant des changements d’ouverture et de flux du Ca2+ qui avaient un impact direct sur la fonction dégradative des invadosomes. De plus, les travaux de génétiques ont décrit SRC et HCK comme des régulateurs redondants des invadosomes (Soriano, 1996). Un second travail a consisté à questionner cette redondance pour potentiellement révéler des spécificités de fonction. SRC et HCK ont-elles un rôle synergique dans les processus invasifs ? Notre approche a consisté à faire exprimer à des cellules immunitaires une protéines SRC ou HCK activable par stimulus lumineux, dénommées OptoSRC (OS) et OptoHCK (OH) (kinase fusionnée à Cry2). Par ce procédé de biotechnologie il nous a été possible d’induire une oligomérisation et une activation de OS et de OH en réponse à la lumière. Nous avons pu montrer que OS et OH activés avaient des sites d'actions à la membrane plasmique bien distincts, OS s'accumulant dans les sites adhésifs et indépendamment du type cellulaire. A l'inverse OH activé ne s'associe qu'avec des compartiments d'endo-exocytose atypiques et uniquement dans les cellules myéloïdes. L'activation de OS et OH dans les Raw-246.7 nous a permis de faire une étude phénotypique des fonctions de ces deux kinases activées. Nous avons pu montrer l'effet promoteur de OS sur la formation des invadosomes. A l'inverse, OH a présenté un caractère déstabilisant sur ces organelles. Paradoxalement, OS et OH restent toutes deux capables de promouvoir la dégradation de matrice de fibrinogène extracellulaire mais via des mécanismes différents. Enfin, notre approche optogénétique nous a permis une étude approfondie de la signalisation de OS et OH par phospho-protéomique démontrant à la fois une signature signalétique spécifique à chacune mais aussi une intrication des signalisations OS et OH. En complément, il a été possible d'identifier le domaine SH2 comme le module de redondance entre SRC et HCK ainsi que celui apportant la spécificité à chacune de ces kinases, le domaine SH3. Par cette étude il nous a donc été permis de mieux détailler le principe mécanistique de ces deux kinases homologues et leurs rôles synergiques dans le processus d'invasion du macrophage.Cell invasion is often mediated by the establishment of a family of specialized subcellular structures, invadosomes, regulated in part by members of the SRC family (SFK), including HCK. They are present in macrophages and re-expressed by metastatic cells (Murphy, 2011). These structures couple adhesion to and degradation of extracellular matrices (Destaing et al., 2014). Thus, the work of this thesis focused on the regulatory signaling of invadosomes in different cellular contexts. A first study allowed us to highlight the importance of Ca2+-dependent signaling mediated by the TRPV4 calcium channel. We demonstrated that this channel was sensitive to reactive oxygen species (ROS) inducing opening modulation of the channel and changes in Ca2+ flux that had a direct impact on the degradative function of invadosomes. In addition, genetic work described SRC and HCK as redundant regulators of invadosomes (Soriano, 1996). Our second work consisted in invastigation of this redundancy to potentially reveal specificities of function. Do SRC and HCK have a synergistic role in invasive processes? Our approach consisted in making immune cells expressing a protein SRC or HCK activable by light stimulus, named OptoSRC (OS) and OptoHCK (OH) (kinase fused to Cry2). Through this biotechnology process we were able to induce oligomerization and activation of OS and OH in response to light. We were able to show that activated OS and OH had distinct sites of action at the plasma membrane, with OS accumulating in adhesive sites and independently of cell type. In contrast, activated OH associates only with atypical endo-exocytosis compartments and only in myeloid cells. The activation of OS and OH in Raw-246.7 allowed us to perform a phenotypic study of the functions of these two activated kinases. We were able to show the promoter effect of OS on the formation of invadosomes. Conversely, OH showed a destabilizing effect on these organelles. Paradoxically, both OS and OH remain able of promoting the degradation of extracellular fibrinogen matrix but via different behaviors. Finally, our optogenetic approach allowed us to study in depth the signaling of OS and OH by phospho-proteomics, demonstrating a specific signaling signature for each of them but also an intrication of OS and OH signaling. In addition, it was possible to identify the SH2 domain as the redundancy module between SRC and HCK as well as the one bringing specificity to each of these kinases, the SH3 domain. This study allowed us to better understand the mechanistic principle of these two homologous kinases and their synergistic roles in the macrophage invasion process