Heterogeneous Cascade Oxidations Catalyzed by Mesoporous Artificial Enzymes

Ce projet de thèse s’est articulé autour de la mise au point de métalloenzymes artificielles et de la catalyse hétérogène. Dans le but de contribuer au development des réactions abiotiques catalysées par ces enzymes, nous nous sommes interessés aux reactions d’époxydation d'alcène et de cycloaddition du CO2, dans le cadre d’un réaction cascade. Pour y parvenir, nous avons proposé une series d’ enzymes epoxydases produites selon deux modes de préparation distincts à partir de la protéine NikA,. Le premier repose sur des interactions supramoléculaires entre les résidus présent dans la cavité de la protein et le complexe. Le second est basé sur la modification covalente d'une cystéine introduite dans NikA par mutagenese dirigée. Ceci a conduit au développement de cinq époxydases artificielles qui ont démontré des activités intéressantes avec l'acide peracétique et l'époxydation aérobie selon la méthode de Mukaiyama. Un des principaux acquis de ce travail est la demonstration du mode d’insertion covalente, démontré par diffraction X et spectrometrie de masse. Egalement, nos efforts d’optimisation ont mis en lumière l'influence de la méthodologie de préparation des métalloenzymes artificielles sur la stéréosélectivité de la réaction. En effet, l'optimisation des essais d'ancrage covalent d’un complexe Mn(salen) modifié sur le mutant NikA-H416C a conduit à un excès énantiomérique de 90% sur l'époxydation aérobie du cis-β-méthylstyrène. Pareillement, le mutants cysteines de NikA associés à un complexe Co(salen) lié de manière covalente, ont conduit à la production d’enzymes pour la cycloaddition du CO2 qui se sont avérées efficaces dans des conditions assez douces. L'association de ce complexe Co(salen) avec un complexe d'époxydation portant un mode d’ancrage orthogonal (interaction supramoléculaire) sur un échafaudage mutant NikA unique, a permis la création d’une enzyme duale capable de catalyser une transformation d’époxydation-cycloaddition du CO2 en cascade. Cette enzyme s'est avérée active pour la formation de carbonates cycliques à partir du styrène et stable jusqu’à cinq essais catalytiques independants. Bien que une optimisations de ces systémes soit nécessaire, ce projet a ouvert la voie à la conception d’enzymes artificielles à partir de la protéine NikA grâce à une récente méthodologie d'ancrage, la modification covalente, orthogonale au mode d'ancrage supramoléculaire caractéristique de la cavité de NikA. Ce travail permettrra d’ouvrir de nouveaux champs d’applications pour les enzymes artificielles en biologie de synthèse.This thesis project was built around the principles of artificial metalloenzymes and heterogeneous catalysis. In an attempt to fill the gap in the development of abiotic reactions catalysed by artificial metalloenzymes, we aimed at the design of a series of artificial metalloenzymes with distinct and interesting catalytic activities: alkene epoxidation, CO2 cycloaddition leading to the design of a dual-site artificial metalloenzyme for cascade transformations. Moreover, we ambitioned to exploit the protein environment in order to induce chirality throughout our investigations on alkene epoxidation. Working on the protein NikA, we have successfully reported a series of artificial epoxidases based on two deferent preparation modes. The first one relyed on the supramolecular interactions native cavity of the NikA. The second was based on covalent modification of a cysteine bearing NikA mutants through a Michael addition. This led to the development of five artificial epoxidases that displayed interesting activities with peracetic acid and Mukayama aerobic epoxidation. Interestingly, our investigations have put to light the influence of the artificial metalloenzymes preparation methodology on the stereoselectivity of the reaction. Indeed, optimization of anchoring assays led to an enantiomeric excess of 90% on the aerobic epoxidation of cis-β-methylstyrene with the NikA mutanat H416C associated to a modified Mn(salen) ligand. Working on the same protein scaffold, associated with a covalently linked co(salen) complex have led to the production of a new ArM for CO2 cycloaddition that was efficient under quite mild conditions. Associating this complex with an epoxidation complex on a sole NikA mutant scaffold has allowed the creation of a dual ArM able to perform a cascade transformation to form cyclic carbonates from styrene through and epoxidation-CO2 cycloaddition pattern. This dual ArM was proven to be active and stable for up to five runs. Although further optimization is needed, this project has pathed the way of ArM design from the NikA protein through a novel anchoring methodology, covalent modification, orthogonal to the characteristic supramolecular anchoring mode of NikA’s binding cavity