Étude des changements métaboliques comme biomarqueurs prédictifs de la transformation maligne des lésions précancéreuses de la peau

Les carcinomes épidermoïdes cutanés (CEC) sont en constante augmentation du fait des habitudes d’exposition solaire et du vieillissement de la population. Le CEC est un modèle de carcinogenèse en plusieurs étapes : de la lésion précancéreuse, la kératose actinique (KA) au CEC in situ puis infiltrant jusqu’au stade métastatique. Bien que sa prise en charge initiale ne présente pas d’enjeu thérapeutique (exérèse chirurgicale), plus de 4% de ces CEC récidiveront sous la forme de métastases, avec des conséquences dramatiques en termes de morbi-mortalité (mortalité de 1.5%).Notre équipe a récemment découvert que des modifications métaboliques spécifiques précédaient la formation des CEC. Nos données indiquent que : 1) les voies de biosynthèse de la pyrimidine et de la purine sont up-régulées dans les différents stades de la carcinogenèse induite par les UVB et que : 2) l'activation de l’enzyme DHODH (4ème étape dans la synthèse de la pyrimidine) située sur la membrane mitochondriale, est essentielle à la biosynthèse des nucléotides et à la génération d’énergie lors cette respiration mitochondriale. Ce « nœud » métabolique reliant les acides nucléiques à la respiration pourrait constituer une cible d’intérêt stratégique.En conséquence, la première partie de ma thèse a consisté en la caractérisation du profil métabolique des CEC, aux différents stades de la carcinogenèse, puis d’étudier l’effet de l’inhibition de l’enzyme DHODH en fonction des profils métaboliques.Grâce à l’étude translationnelle Mitoskin (étude prospective monocentrique au CHU de Bordeaux) en analysant par la protéomique les différents voies impliquées dans le métabolisme énergétique (glycolyse, phosphorylation oxydative, cycle de Krebs, beta oxydation des acides gras) nous avons classé les patients par leurs score métabolique en 3 sous-groupes avec un score métabolique haut, intermédiaire et faible où toutes les protéines impliquées dans les différentes voies du métabolisme sont abaissées. Nous avons ensuite sélectionné plusieurs lignées CEC en fonction de leur profil métabolique et les avons xénogreffées chez la souris NSG : la croissance tumorale s’est avérée différente en fonction des profils ainsi que le potentiel métastatique. L’administration du Leflunomide (LFN), inhibiteur de l’enzyme, a inhibé la croissance tumorale des lignées « faible » et « intermédiaire » exprimant de façon plus importante l’enzyme. A l’inverse, en surexprimant l’enzyme DHODH dans la lignée cellulaire résistantes au LFN (lignées avec score métabolique haut), nous avons réversé la résistance au traitement et rendu les tumeurs sensibles au LFN.La deuxième partie de mon projet a consisté en la caractérisation des différentes populations immunitaires constituant les CEC agressifs localement avancés en les comparant à une lésion précancéreuse présente sur un même patient, grâce au séquençage de l’ARN en cellule unique (Single Cell RNA Sequencing, ScRNA-Seq) et à la transcriptomique spatiale. Après tri des cellules immunitaires CD45+, j’ai pu identifier 19 clusters immunitaires, dont certains clusters étaient sous-représentés (notamment les lymphocytes B et les cellules plasmacytoïdes) ou apparaissaient lors du passage à la forme tumorale, notamment 2 clusters semblant spécifiques à la forme tumorale : macrophagique et lymphocytaire.En conclusion, mon travail de thèse a exploré les voies du métabolisme des CEC aux différents stades de la carcinogenèse et pu mettre en évidence qu’il existait 3 signatures métaboliques pouvant être utilisé comme biomarqueurs. Cibler DHODH en fonction des différents profils métaboliques semble être une alternative intéressante en cas d’impasse thérapeutique. Enfin, le travail sur la caractérisation des sous-populations immunitaires pourrait ouvrir la voie à de nouvelles cibles thérapeutiques.Cutaneous squamous cell carcinomas (cSCCs) are one of the most frequent malignancies worldwide, with substantial associated morbidity and cost. A better understanding of the molecular changes involved in the transformation of this UVB-induced precancerous lesions (actinic keratosis (AK)) to localized tumors and then to metastasis will aid in early detection, development of biomarkers and future targeted treatment strategies. Here we aimed at characterizing the molecular and metabolic features of cSCC at different stages of carcinogenesis and their immunologic landscapes in order to uncover clinically relevant biomarkers predicting the cSCC evolution risk. Our previous work showed that metabolic reprogramming occurs at an early stage of carcinogenesis during cSCC progression through the activation of DHODH. Dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) is the rate-limiting enzyme in the uridine monophosphate (UMP) biosynthetic pathway and mostly located in the inner membrane of mitochondria, catalyzing the transformation of dihydroorotate to orotate. It has emerged as a new therapeutic target in a wide spectrum of malignancies as de novo pyrimidine synthesis is extensively used in rapidly proliferative cancer cell lines.To investigate metabolic heterogeneity in cutaneous squamous cell carcinoma (cSCC), 60 samples from patients with various stages of cSCC ranging from precancerous actinic keratosis to metastatic cSCC were subjected to proteomic analysis. Three subgroups with low-, medium- and high- metabolic were detected in all stages of carcinogenesis. To examine the functional impact of the detected metabolic heterogeneities on tumor features and their responses to treatment, human cSCC cell lines with different metabolic activities were transplanted subcutaneously into mice. Evaluation of tumor growth revealed that cell lines had different aggressiveness and metastatic potential according to their metabolic profile. Interestingly, the restraining effect of DHODH inhibition (with leflunomide, LFN) on tumor growth and metastatic potency also depended on metabolic profiles of the cells. We found that the expression level of DHODH was also different between cell lines and can be a predict marker for the sensitivity to DHODH inhibition. DHODH overexpression in refractory cell lines to LFN rendered them sensitive to DHODH inhibition.To explore immunologic landscapes of cSCC at different stages of carcinogenesis, single cell RNA sequencing (scRNAseq) was applied on a premalignant and an aggressive sample of cSCC from 4 patients. We uncovered several immune cell subsets depleted in cSCC compared to AK, particularly B cells and plasma cells, and a specific cluster of macrophages and T cells enriched in the tumor compared to AK. We also performed spatial transcriptomic using GeoMx DSP and found that a metabolic rewiring of immune cells when tumoral formation is occurring.To conclude, our data suggest that metabolic and immune features of cSCC could be used as pertinent biomarkers for stratification of cSCC. Targeting DHODH through disruption of the pyrimidine biosynthesis is a potential therapeutic target in a subgroup of cSCC with a particular metabolic profile and that DHODH expression level can be used as a predicted biomarker of response to DHODH inhibition-based metabolic therapy