Activity-dependent maturation of the perinatal mouse cortex

The developing brain demonstrates spontaneous electrical activity at the early embryonic stages. Electrical activity promotes birth, migration and integration of neurons, and formation of neuronal circuits in the developing mammalian cortex. Disruption of any of these processes may lead to misbalance and such neurological disorders as epilepsy, autism spectrum disorders, schizophrenia and other developmentally related pathologies. These neurological disorders seriously affect the everyday life of patients. However, the activity-dependent mechanisms that take part in forming healthy neuronal networks as well as in the etiology of developmental disorders are still unclear. The generation of neuronal depolarization causing changes in intracellular calcium concentrations is fundamental for subthreshold and spiking electrical brain activity. In view of this, observing calcium activity at early developmental stages may provide insights into the dynamic processes of neuronal communications and help to disclose the related activity-dependent developmental mechanisms. With this in mind, we developed a method for studying cortical calcium activity in live mice embryos connected to the mother (Study I). This enabled us to investigate the properties of evoked calcium waves in vivo with a preserved blood flow between the mother and embryos. Using precise single-cell high-power two-photon laser stimulation, we recorded adenosine triphosphate (ATP)-dependent waves in the cortex of embryos with a preserved mother-embryo interface at embryonic day (E) 14. The analysis revealed two types of evoked calcium waves, pointing to the presence of cells with different types of connectivity at this early stage of development. In Study II, we investigated the properties of Cajal-Retzius cells at early embryonic stages. We improved the imaging technique by introducing inhalation isoflurane anesthesia and observed two types of spontaneous calcium waves present at E14-E15 (sporadic and correlated). We compared the effect of common anesthetics (isoflurane and ketamine/xylazine) on the appearance of spontaneous activity. Our results showed a rapid penetration of anesthetic through the placental barrier and a shutdown of spontaneous activity in the embryos when the mother was under ketamine/xylazine anesthesia. Direct injection of ketamine/xylazine into the embryos produced a similar robust effect and a cessation of cell motility. These results suggest the presence of NMDA-sensitive calcium activity at this stage of development. Lastly, we looked into the role of activity in the postnatal cortex maturation (Study III). We chemogenetically silenced pyramidal neuron layer 2/3 in the somatosensory cortex and followed the distribution of interneurons. We observed a significant reduction in the number of late-born interneurons in the somatosensory cortex without signs of apoptosis. Interestingly, we noticed excessive numbers of interneurons in both the granular insular and secondary motor cortex. Using the same approach for silencing pyramidal neurons, we examined calcium activity patterns 2 and 7 days later and observed immature calcium patterns. These data suggest that interneuron migration is activity-dependent, and that migration streams adjust quite rapidly to the activity changes in the cortical layers. The results from bulk RNA-sequencing revealed 120 up- and down-regulated genes that might contribute to the process, with the most prominent candidate being atypical vesicular glutamate transporter 3 (VGLUT3). In summary, the work provides insights into the activity-dependent formation of the mouse cortex and its networks at the perinatal stages of development.Alkionkehityksen aikana aivoissa esiintyy spontaania sähköistä aktiivisuutta. Sähköinen aktiivisuus edistää hermosolujen syntyä, vaellusta ja integroitumista sekä hermoverkkojen muodostumista nisäkkäiden kehittyvällä aivokuorella. Näiden prosessien häiriintyminen voi johtaa aivotoiminnan epätasapainoon, ja sen seurauksena neurologisten häiriöiden, kuten epilepsian, autismikirjon häiriöiden, skitsofrenian sekä muiden kehitykseen liittyvien patologioiden, ilmenemiseen. Nämä neurologiset häiriöt vaikuttavat merkittävästi potilaiden jokapäiväiseen elämään. On kuitenkin edelleen epäselvää, miten aktiivisuudesta riippuvaiset mekanismit vaikuttavat hermoverkkojen muodostumiseen, sekä kehityshäiriöiden etiologiaan. Hermosolujen depolarisaatio, joka aiheuttaa muutoksia solunsisäisissä kalsiumpitoisuuksissa, on olennaisen tärkeä kynnysarvon alapuolella (”subthreshold”) tapahtuvalle ja piikkipurkaus-tyyppiselle sähköiselle aktiivisuudelle. Näin ollen varhaisten kehitysvaiheiden kalsiumaktiivisuuden seuraaminen voi tarjota tietoa hermosolujen viestinnän dynaamisista prosesseista ja auttaa selvittämään siihen liittyviä aktiivisuudesta riippuvaisia kehitysmekanismeja. Tätä ajatellen kehitimme menetelmän, jota hyödynsimme tutkiaksemme aivokuoren kalsiumaktiivisuutta elävissä emoon yhteydessä olevissa hiirialkioissa (Tutkimus I). Kyseinen menetelmä mahdollisti indusoitujen kalsiumaaltojen tutkimisen in vivo asetelmassa, jossa emon ja alkioiden välinen verenkierto säilyi. Rekisteröimme emossa kiinni olevien 14 päivän ikäisten (E14) alkioiden aivokuoren adenosiinitrifosfaatista (ATP) riippuvaisia aaltoja käyttämällä täsmällistä yksittäisen solun suuritehoista kaksifotoni laserstimulaatiota. Analyysi paljasti kahdenlaisia indusoituja kalsium-aaltoja osoittaen, että tässä varhaisessa kehitysvaiheessa esiintyy soluja, joilla on erityyppisiä kytkentöjä. Tutkimuksessa II tutkimme Cajal-Retzius-solujen ominaisuuksia alkionkehityksen varhaisvaiheissa. Paransimme kuvantamistekniikkaa ottamalla käyttöön inhalaatioisofluraanianestesian ja havaitsimme kahdenlaisia spontaaneja kalsiumaaltoja E14-E15 alkioissa: sporadisia ja korreloituneita. Vertailimme tavanomaisten anestesia-aineiden (isofluraani ja ketamiini/ksylatsiini) vaikutusta spontaaniaktiivisuuden esiintymiseen. Tulostemme mukaan emon ollessa ketamiini/ksylatsiinianestesian vaikutuksen alaisena anesteetit läpäisevät istukan nopeasti ja alkion hermosolujen spontaaniaktiivisuus tyrehtyy. Ketamiinin/ksylatsiinin suora injektio alkioihin tuotti samanlaisen voimakkaan vaikutuksen ja lakkautti solujen liikkuvuuden. Nämä tulokset viittaavat siihen, että tässä kyseisessä alkioiden kehitysvaiheessa esiintyy NMDA-riippuvaista kalsiumaktiivisuutta. Lopuksi tarkastelimme aktiivisuuden merkitystä syntymän jälkeisessä aivokuoren kypsymisessä (Tutkimus III). Vaimensimme kemogeneettisesti tuntoaivokuoren kerroksen 2/3 pyramidisoluja ja seurasimme välihermosolujen jakautumista. Tuloksemme osoittivat myöhään syntyneiden välihermosolujen määrän merkittävää vähenemistä tuntoaivokuorella ilman merkkejä apoptoosista. Mielenkiintoista oli, että havaitsimme ylimäärän välihermosoluja sekä granulaari-insulaarisella aivokuorella että sekundäärisellä motorisella aivokuorella. Käyttämällä samaa lähestymistapaa pyramidisolujen hiljentämiseen, tutkimme aktiivisuutta sekä kaksi että seitsemän päivää myöhemmin ja havaitsimme kehittymätöntä kalsiumaktiivisuutta. Nämä tulokset viittaavat välihermosolujen vaelluksen olevan aktiivisuudesta riippuvainen ja vaellusvirtojen sopeutuvan melko nopeasti aivokuoren kerrosten aktiivisuusmuutoksiin. Massa-RNA-sekvensoinnin tulokset paljastivat 120 yli- ja alisäädeltyä geeniä, jotka saattavat vaikuttaa tähän prosessiin, ja joista merkittävin ehdokas on epätyypillinen vesikulaarinen glutamaattikuljettaja 3 (VGLUT3). Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimustuloksemme tarjoavat tietoa hiiren aivokuoren ja sen verkostojen aktiivisuudesta riippuvaisesta rakentumisesta perinataalisessa kehitysvaiheessa