Tissue-specificity of mitochondrial proteostasis in health and disease

Mitochondrial function is critical to the health, disease, and aging in eukaryotes. These cellular organelles are responsible for generating energy and carrying out vital metabolic functions. Mitochondria need to maintain a fine balance in their proteome for effective functioning. This protein homeostasis or proteostasis in mitochondria is maintained by the coordination between protein import form cytosol and the synthesis in their matrix. Moreover, chaperones, proteases, and regulatory elements of cellular and mitochondrial proteostasis pathway ensure their proteomic fitness. Defects in any of the pathways maintaining the proteostasis affects the mitochondrial and then other organellar and ultimately the overall cellular function. Altered mitochondrial function is likely to cause diseases, affecting different organs or systems at different life stages. The main aim of this dissertation was to investigate how defects in mitochondrial protein import pathway affects the proteostasis and then the organismic growth and development in mice. The mitochondrial chaperone mtHSP70 regulates the import of proteins into mitochondrial matrix and their folding. The nucleotide exchange factors (NEF), GRPEL1 and GRPEL2 in mammals, are thought to be critical for mtHSP70 function, but their precise roles are not known. To characterize their importance, in vivo knockout mouse of each of these NEF were generated and phenotypic and molecular characterization was performed. It was found that loss of GRPEL1 is embryonic lethal in mice, thus confirming that it is critical for the survival from a very early stage of development. Furthermore, skeletal muscle specific knockout model of GRPEL1 was made by using a tamoxifen inducible Cre recombinase. It was found that loss of GRPEL1 even in adult mice is detrimental. The important mitochondrial functions such as oxidative phosphorylation and fatty acid oxidation were shut down and stress responses were activated due to protein mislocalization and proteotoxicity arising from the faulty protein import system. The defective proteostasis maintenance initiated an interorganellar communication but ultimately caused rapid muscular atrophy, weight loss and massively reduced lifespan. The knockout mouse for the other paralog GRPEL2 was also generated. In contrast to GRPEL1 knockout mice, loss of GRPEL2 did not affect the development or growth of the mice. These mice were resistant to age- and diet-induced weight gain, and able to maintain a better metabolic fitness. Transcriptomic analysis showed white adipose tissue remodeling. The gene expression changes were opposite to the transcriptomic profile of obese mice indicating the anti-obesity like molecular changes in GRPEL2 knockout mice. Moreover, analysis of brown adipose tissue indicated that the loss of GRPEL2 reduced the lipid storage and mildly affected the mitochondrial respiration but improved the cold tolerance. Overall, it was found that GRPEL1 is the housekeeping co-chaperone of mtHSP70 and is critical for mitochondrial function whereas GRPEL2 is the dispensable paralog and might have a tissue-specific fine-tuning role as a metabolic regulator. Next, we investigated how impaired maintenance of mitochondrial proteostasis by disruption of mitochondrial protein synthesis led to human disease on a clinical study where we described a new genetic cause for early-onset spastic paresis, a motor neuron disease. We found a splicing variant in the mitochondrial seryl-tRNA synthetase (SARS2) gene, which is an essential enzyme for mitochondrial protein synthesis, charging two tRNAs with serine in mitochondria. This finding was intriguing since missense mutations in SARS2 have been previously described to cause a kidney disorder called HUPRA syndrome. We showed that the splicing mutation led to severe reduction in the SARS2 protein level in the patient’s fibroblasts, triggering an instability of tRNASer(AGY). Our study further adds to the tissue-specific complexity of phenotypes caused by mitochondrial tRNA synthetases. Thus, this dissertation work investigated both aspects of mitochondrial proteostasis, mitochondrial protein import and protein synthesis in its matrix. It emphasizes the importance of mitochondrial proteostasis and how defects in its maintenance compromises the health and survival in a tissue-specific manner in mammals.Mitokondrioiden toiminta on elintärkeää ihmisen terveydelle ja vaikuttaa sairauksien kehittymiseen ja ikääntymiseen. Nämä soluorganellit tuottavat energiaa ja osallistuvat moniin aineenvaihdunnan prosesseihin. Mitokondriot tarvitsevat toimiakseen suuren määrän proteiineja eli proteomin, jonka tasapainon ylläpito on tärkeää. Mitokondrion proteostaasiin eli proteiinihomeostaasiin vaikuttaa sekä proteiinien kuljetus mitokondrioon solulimasta että mitokondrion oma proteiinisynteesi. Lisäksi lukuisat kaperonit, proteaasit ja muut tekijät säätelevät proteomin tasapainoa. Häiriöt proteostaasissa vaikuttavat haitallisesti mitokondrioiden toimintaan ja edelleen muihin soluorganelleihin ja lopulta koko solun selviämiseen. Epänormaali mitokondrioiden toiminta altistaa sairauksille, vaikuttaen eri tavoin eri kudosten toimintaan. Tämän väitöstutkimuksen päätavoitteita oli tutkia mitokondrion proteiinikuljetuksen häiriöiden vaikutuksia proteostaasiin ja edelleen kasvuun ja kehittymiseen hiirillä. Mitokondriaalinen kaperoni mtHSP70 säätelee proteiinien kuljetusta mitokondrion matriksiin. Nisäkkäillä on kaksi nukleotidinvaihtajaproteiinia, GRPEL1 ja GRPEL2, joiden ajatellaan olevan tärkeitä mtHSP70-kaperonin säätelijöitä, mutta niiden tarkkaa tehtävää ei tunneta. Tässä työssä tutkittiin näiden kahden nukleotidivaihtajaproteiinin toimintaa mitokondrion proteostaasissa poistogeenisten hiirten avulla. GRPEL1 osoittautui elintärkeäksi proteiiniksi hiirissä, sillä sen puutos johti kuolemaan aikaisessa kehitysvaiheessa. Lisäksi poistimme GRPEL1:n hiirten lihaksista käyttäen tamoksifeenilla indusoitua Cre-rekombinaasia. Tulos osoitti, että GRPEL1:n puutos on erittäin haitallinen myös aikuisilla hiirillä. Estynyt proteiinien kuljetus mitokondrioihin johti mitokondrioiden toimintojen kuten soluhengityksen ja rasvahappojen oksidaation vähentymiseen, ja johti voimakkaisiin proteotoksisiin stressireaktioihin. Häiriintynyt proteostaasin ylläpito käynnisti soluorganellien välisiä viestintäreaktioita, mutta johti lopulta nopeaan lihasten surkastumiseen, painon putoamiseen ja ennenaikaiseen kuolemaan. Päinvastoin kuin GRPEL1:n puutos, GRPEL2-proteiinin poistaminen ei vaikuttanut hiirten kasvuun tai kehitykseen. GRPEL2-hiirten aineenvaihdunta oli kuitenkin poikkeava siten, että niiden paino ei merkittävästi noussut iän tai rasvaisen ruokavalion myötä toisin kuin kontrollihiirillä. Valkoisen rasvan geenisäätelyn muutokset olivat GRPEL2-hiirillä vastakkaiset kuin ylipainoisilla kontrollihiirillä. Lisäksi niiden ruskeassa rasvassa oli vähemmän rasvaa varastoituneena ja soluhengitys oli hieman vähentynyt, mutta niillä oli parempi lämmönsäätely kylmäaltistuksessa. Yhteenvetona tutkimuksessa selvisi, että GRPEL1 on elintärkeä mtHSP70-kaperonin säätelijä kun taas GRPEL2 ei ole välttämätön hiirten kehitykselle ja kasvulle, mutta se voi olla uusi kudoskohtainen aineenvaihdunnan hienosäätäjä. Seuraavaksi tutkimme kuinka häiriö mitokondrion proteiinisynteesissä voi johtaa kudoskohtaiseen sairauteen ihmisillä. Tunnistimme uuden geneettisen syyn aikaisin alkavalle spastiselle pareesille, joka on liikehermojen sairaus. Löysimme mitokondriaalisen seryyli-siirtäjäRNA syntetaasin (SARS2) geenivirheen, joka johtaa silmukoinnin häiriöön kyseisessä geenissä. SARS2 tarvitaan mitokondrion proteiinisynteesissä liittämään seriini kahteen siirtäjäRNA:han. Tulos on yllättävä, sillä aiemmin tunnistetut SARS2-geenivirheet ovat aiheuttaneet munuaissairautta nimeltä HUPRA syndrooma. Osoitimme, että uusi SARS2-geenin silmukointivirhe johtaa SARS2-proteiinin merkittävään vähenemiseen potilaan ihosoluissa, aiheuttaen siirtäjä-RNA Ser(AGY):n määrän vähenemisen. Tutkimuksemme tulos osoittaa, että mitokondrion proteiinisynteesin häiriöissä jopa saman geenin erilaiset geenivirheet voivat johtaa erilaisiin kudoskohtaisiin sairauksiin. Tämä väitöstutkimus toi lisätietoa mitokondrion proteostaasiin vaikuttavista tekijöistä sekä proteiinien kuljetuksen että mitokondrion oman proteiinisynteesin osalta. Tuloksissa korostuvat proteostaasin ylläpidon tärkeys, ja sen vaikutus terveyteen hiirillä ja ihmisillä