QM/MM Berechnungen an der Membran gebundenen Hydrogenase von Ralstonia eutropha

Molekularer Wasserstoff ist ein einfaches Molekül, das in der Knallgasreaktion mit Sauerstoff viel Energie freisetzt (572 kJ/mol). Aus diesem Grund wird es immer häufiger als saubere Energiequelle und als Alternative zu CO2 emittierenden Verbrennungsenergiequellen in Betracht gezogen. Hydrogenasen sind Metallenzyme, die in der Lage sind, Wasserstoff bei milden Reaktionsbedingungen zu aktivieren und in zwei Protonen und zwei Elektronen zu spalten. Da dies ein reversibler Prozess ist, können Hydrogenasen zur effizienten Lagerung und Freisetzung großer Energiemengen eingesetzt werden. Aus diesem Grund gewinnen sie immer mehr Aufmerksamkeit, da sie ein besonderes Potential in bioenergetischen Verwendungen für die alternative Treibstoffproduktion aufweisen. Allerdings sind die meisten Hydrogenasen sehr empfindlich gegenüber Sauerstoff. Die in dieser Arbeit untersuchte membrangebundene Hydrogenase (MBH) von Ralstonia eutropha kann Wasserstoff auch in der Gegenwart von natürlichen Sauerstoffmengen umsetzen. Ein detailliertes Wissen über den Mechanismus der reversiblen Wasserstoffspaltung und der Sauerstofftoleranz würde sehr zur Entwicklung biomimetischer Katalysatoranwendungen beitragen. Diese Mechanismen sind jedoch immer noch nicht im Detail geklärt. Das Ziel dieser Arbeit war es, strukturelle Details des katalytisch aktiven [NiFe] Zentrums, an dem dieWasserstoffreaktion statt findet, und des proximalen Eisen-Schwefel-clusters, der eine wichtige Rolle in der Sauerstofftoleranz der MBH spielt, zu klären. Dazu wurden theoretische Berechnungen der Schwingungseigenschaften mittels des quantenmechanischen/molekularmechanischen (QM/MM) Ansatzes in Kombination mit molek¨uldynamischen (MD) Simulationen durchgeführt. Bevor die röntgenkristallographische Struktur der MBH von Ralstonia eutropha verfügbar war, wurde in Kapitel 5 ein Strukturmodel für das Enzym mit Hilfe der Homologiemodell- Technik erstellt. Die modellierte Struktur wurde durch den Vergleich von QM/MM berechneten Infrarotspektren (IR) mit experimentellen Ergebnissen best¨atigt. Diese modellierte MBH ermöglichte erstmals Einblicke in die Struktur des aktiven Zentrums einer sauerstofftoleranten Hydrogenase. In Kapitel 6 wurde die absolute Konfiguration der an Eisen gebundenen, anorganischen Liganden im aktiven Zentrum aufgeklärt und best¨atigte vorherige Vorschläge für die strukturelle Konfiguration. Diese Arbeit trug außerdem dazu bei, Zuordnungsprobleme der anorganischen Liganden im aktiven Zentrum der röntgenkristallographisch bestimmten Struktur der reduzierten MBH, die 2011 veröffentlicht wurde, zu klären. Nachdem die Kristallstruktur der reduzierten MBH veröffentlicht worden war, wurden schwingungsspektroskopische Berechnungen auf QM/MM Level in Kombination mit MD Simulationen an verschiedenen reduzierten und lichtinduzierten Zuständen des aktiven Zentrums durchgeführt und mit experimentellen Resonanz Raman (RR) Spektren verglichen. Die Ergebnisse demonstrierten das Potential der RR Spektroskopie als Alternative zur IR Technik, Signale des aktiven Zentrums zu messen. In Kombination mit theoretischen Berechnungen konnte ein lichtinduzierter Zustand identifiziert und seine zuvor vorgeschlagene Struktur bestätigt werden. In Kapitel 8 werden die Ergebnisse zu ähnlichen Berechnungen wie in Kapitel 7 an verschiedenen Zuständen der oxidierten MBH vorgestellt. Zusätzlich wurden schwingungsspektroskopische Berechnungen für den proximalen Eisen-Schwefel-Cluster der superoxidierten MBH durchgeführt. Der Vergleich mit experimentellen RR Spektren bestätigte die Anwesenheit eines an ein Eisenatom des proximalen Clusters gebundenen Hydroxylliganden, der auch in der röntgenkristallographischen Struktur des oxidierten Enzyms detektiert werden konnte. Außerdem ermöglichten die QM/MM Rechnungen die Zuordnung aufgezeichneter Signale vom aktiven Zentrum zum aktivierten Zustand der MBH. Schließlich wird in Abschnitt 4.2 die Simulation von resonanzverstärkten Raman-Intensitäten behandelt. Hierzu wurde ein neuer Ansatz entwickelt und angewendet, der Raman-Intensitäten auf der Basis individueller Schwingungsbeiträge zur potentiellen Energie gewichtet.Molecular hydrogen is a simple molecule which releases a large amount of energy when reacting with oxygen in the Knall-Gas-Reaction (572 kJ/mol). For this reason it is more frequently used as a clean energy source and as an alternative to CO2 emitting combustioning energy sources. Hydrogenases are metalloenzymes that are able to activate the hydrogen molecule at mild reaction conditions and cleave it into two protons and two electrons. Since this is a reversible process hydrogenases might be utilized to efficiently store and release high amounts of energy. For this reason gained a lot of attention given its particular potential in bioenergetic applications for alternative fuel productions. However, most hydrogenases are very sensitive towards oxygen. The membrane bound hydrogenase (MBH) from Ralstonia eutropha examined in this work is able to metabolize hydrogen even at ambient oxygen levels. Detailed knowledge of the mechanisms for the reversible hydrogen cleavage and the oxygen tolerance would greatly contribute to biomimetic catalysts applications. However, these mechanisms are still not clarified in all detail. The aim of this work was to elucidate structural details at the [NiFe] active site, where the hydrogen reaction takes place, and at the proximal iron sulfur cluster, which is essential for the oxygen tolerance of the MBH. As a tool, theoretical calculations of vibrational properties using the hybrid quantum mechanical / molecular mechanical (QM/MM) approach in combination with molecular dynamics (MD) simulations was chosen. Before the x-ray crystallographic structure of the MBH from Ralstonia eutropha became available a structural model of the enzyme was constructed with the homology model technique in chapter 5. The modelled structure was confirmed by the comparison of vibrational infrared (IR) spectra computed at QM/MM level with experimental results. The modelled MBH could give first insights into the structure at the active site of an oxygen tolerant hydrogenase. In chapter 6 the absolute active site configuration of the three inorganic ligands bound to the iron could be revealed, confirming former structural configuration suggestions. This work also aimed clarifying assigning problems concerning the inorganic ligands at the active site of the x-ray crystallographic structure of the reduced MBH published in 2011. After publication of the crystall structure of the reduced MBH, vibrational calculations at QM/MM level in combination with MD simulations on different reduced and light induced states of the active site were performed and compared with experimental resonance Raman (RR) spectra. The results in chapter 7 demonstrate the potential of the RR spectroscopical technique to probe active site signals as alternative to IR spectroscopy. In combination with theoretical calculations a light induced state was identified and its structure previously proposed by Brecht et al. was confirmed. In chapter 8 results are presented for similar calculations as in chapter 7 that were repeated for different active site states of the oxidized MBH. In addition vibrational calculations were carried out on the proximal cluster of the superoxidzed MBH. The comparison with RR experimental results confirmed the presence of a hydroxyl ligand at the iron sulfur cluster, which also has been detected in the crystal structure of the oxidized enzyme[9]. Furthermore, the QM/MM calculations enabled the assignment of probed active site signals to the MBH active state. Finally, the simulation of resonance Raman intensities was addressed and a new approach based on potential energy contribution weighting was developed as introduced in section 4.2