Tissue Engineering von humanen Herzklappen : Voraussetzungen für einen reproduzierbaren Herstellungsprozess

Die derzeitig verwendeten Herzklappenprothesen zeigen gute funktionelle Eigenschaften und führen bei herzerkrankten Menschen zu einer verbesserten Lebensqualität. Ihr Einsatz ist jedoch bei Kindern problematisch, da die Prothesen sich weder in umgebendes Gewebe integrieren, noch Mitwachsen oder Regenerieren. Herzklappen die mittels künstlicher Gewebszucht (Tissue Engineering - TE) hergestellt werden könnten hier eine Lösung darstellen. Für die Herstellung funktioneller TE-Herzklappen sind die Beurteilung einer geeigneten Zellquelle, die Auswahl eines Zellträgermaterials und die in vitro Kulturbedingungen, die zu einem vitalen Klappenersatz führen, grundlegend. Ziel dieser Arbeit war es daher: 1.) Die Eignung arterieller Zellen der humanen Nabelschnur (HUCACs) für das kardiovaskuläre TE zu prüfen, 2.) Eine geeignete biodegradierbare, polymere Vliesstruktur zu eruieren, 3.) Einen Bioreaktor zu entwickeln, der den Zellbesiedelungs- und den in vitro Konditionierungsprozess vereint und 4.) Einen Drehbett-Bioreaktor für die dynamische Expansion von HUCACs zu etablieren. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich HUCACs für das TE von kardiovaskulären Prothesen eignen. Sie wiesen eine ähnliche Struktur und Funktionalität wie die Zellen der Herzklappe auf. Ihre zellulären Marker blieben nach der Expansion erhalten. Sie exprimierten für die spätere Anwendung geeignete extrazelluläre Matrixproteine und zeigten ein angemessenes Proliferationsverhalten. Aus Polyglycolsäure (PGA), Polylactidsäure (PLA) und einem PGA/PLA-Copolymer (PLG) wurden verschiedene Vliese hergestellt, wobei sich PLG Vliese als am Geeignetsten für das kardiovaskuläre TE erwiesen. Diese mit Zellen besiedelten und in vitro kultivierten Vliese zeigten im Vergleich im Inneren eine höhere Zelldichte und eine vermehrte und gleichmäßigere Produktion von extrazellulären Matrixproteinen. Weiterhin konnten in dieser Arbeit im neu entwickelten Bioreaktorsystem großvolumige Gefäße hergestellt werden. Abschließend konnte nachgewiesen werden, dass sich der Drehbett-Bioreaktor für die schnelle Bereitstellung an dynamisch expandierten HUCACs eignete. In dieser Arbeit wurde die Herstellung großer Mengen "vorkonditionierter" HUCACs im Dreh-Bettbioreaktor gezeigt, ohne dass ein Passagieren (Subkultivieren) der Zellen während der Expansion notwendig war. Erste Modifikationen an dem Drehbett-Bioreaktor zeigten, dass sowohl die dynamische Zellexpansion als auch die Zellbesiedlung eines Trägermaterials und die darauffolgende in vitro Konditionierung in einem System integrierbar sind. In weiterführenden Studien ist nun auf die Ergebnisse dieser Arbeit aufbauend ein detaillierteres Wissen erforderlich, um den Einfluss von Fluss und Druck auf TE-Herzklappenprothesen während der in vitro Konditionierung im Bioreaktor genauer zu verstehen.Currently used prosthetic heart valves function well and enable a better quality of life for their recipients. However, they are limited in their application, especially in pediatric patients, because they lack growth and remodelling capabilities. Tissue engineering (TE) of heart valves may overcome these limitations. To achieve success in heart valve TE it is of great importance to determine an appropriate cell source, to select a suitable scaffold material and to establish in vitro conditions that provide an environment permitting the fabrication of viable substitutes. This thesis therefore aimed 1) to characterize human umbilical cord artery derived cells (HUCAC) to confirm their suitability for cardiovascular TE, 2) to establish the suitability of a biodegradable polymeric nonwoven as a scaffold for cell attachment and tissue generation, 3) to design, fabricate and then use a bioreactor system which combines uniform cell seeding and in vitro conditioning of cell seeded scaffolds in one device and 4) to establish a rotating bed bioreactor system for the dynamic expansion of HUCAC. The results demonstrated that HUCAC are suitable for the generation of functional cardiovascular substitutes. They had similar cellular structures and functionalities to native heart valves cells, maintained their marker characteristics after expansion, satisfactorily expressed ECM proteins and exhibited appropriate proliferation properties. Polyglycolic acid (PGA), poly-L/D-lactic acid (P(L/D)LA) and poly-lactide-co-glycolic acid (PLG) were used for the fabrication of different nonwovens as scaffold materials. It was shown that PLG nonwovens were most suitable for the desired application due to the high cellular density of the inner part of the cell seeded nonwoven and the high and even ECM production within the structure. Moreover, successful TE of living, large blood vessels was achieved by seeding HUCAC on PLG nonwovens and subsequent in vitro conditioning in the customized bioreactor system. Further studies demonstrated that the rotating bed bioreactor system is suitable for the fast provision of dynamically expanded HUCAC. In conclusion, the generation of large numbers of "pre-trained" HUCAC without passaging was realized in the rotating bed bioreactor system. Further, first modifications made to achieve a multifunctional bioreactor system have shown that it is possible to incorporate dynamic cell expansion and cell seeding followed by in vitro conditioning of cell seeded scaffolds into one device. However, tissue engineered substitutes are still immature and further developments are indispensable; above all, more detailed knowledge of the effects of flow and pressure during the in vitro conditioning of tissue-engineered heart valves in bioreactor systems is required