Thermostabile Nukleosidphosphorylasen als Biokatalysatoren für die Synthesis von Purin-Nucleosidanaloga

Nukleoside sind bedeutende Bausteine lebender Systeme. Chemisch modifizierte Nukleoside sind hochwirksame Pharmaka für die Behandlung von Krebs und viralen Erkrankungen. Sie sind wichtige Werkzeuge in der Zellforschung, u.a. sind sie Vorstufen für die Herstellung von Oligonukleotiden für theapeutische und diagnostische Anwendungen. Allerdings ist die chemische Synthese von modifizierten Nukleosiden in den meisten Fällen kompliziert und mit niedrigen Ausbeuten verbunden, wodurch ihr Einsatz limitiert ist. Die chemo-enzymatische Synthese von Nukleosidanaloga bietet im Vergleich zur traditionellen chemischen Synthese als eine einfache und „grüne“ Technologie entscheidende Vorteile in Bezug auf Aufwand, Reaktionsausbeuten und Kosten. In der vorliegenden Arbeit liegt der Fokus auf neu isolierten Nukleosidphosphorylasen von verschiedenen thermophilen Mikroorganismen (Deinococcus geothermalis, Geobacillus thermoglucosidasius, Thermus thermophilus, Aeropyrum pernix). Fünf thermostabile Nukleosidphosphorylasen (TtPyNP, GtPyNP, DgPNP, GtPNP and ApMTAP) wurden rekombinant in dem Gram-negativen Bakterium Escherichia coli exprimiert, aufgereinigt und umfassend in Bezug auf die Temperatur- und pH Optima, Stabilität, Substratspezifität, ihr kinetisches Verhalten charaktersisiert, sowie ihre phylogenetische Sequenzähnlichkeit analysiert. Diese Charakteristika demonstrieren die vorteilhaften biokatalytischen Eigenschaften dieser Biokatalysatoren, welches besonders für die Enzyme TtPyNP und GtPNP zutrifft. Unter Reaktionsbedinungen, die für die biokatalytische Syntheses interessant sind, zeichnen sich diese Enzyme nicht nur durch eine hohe katalytische Aktivität gegenüber natürlichen Substraten aus, sondern auch durch ein hohes Maß an Promiskuität, d.h. eine große Anzahl modifizierter Verbindungen als Substrate nutzen können. Beide Enzyme akzeptieren Zucker, die z.B. in folgenden Positionen modifiziert sind: 2’- oder 3’-NH2, 2’-F (ribo- oder arabino-) und 2’-OH (arabino). GtPNP reagiert auch mit 2,6-Cl- oder F-substituierten Purinen. Zusammen können TtPyNP und GtPNP die Synthese verschiedener modifizierter Purinnukleoside katalysieren. Für die Anwendung wurden beide Enzyme auf magnetischen mikrospherischen Trägern immobilisiert. Die Immobilisate zeigten eine hohe Aktivität und eine hohe katalytische Dichte, sowie eine erhöhte Enzymstabilität. Bei der Anwendung dieser immobilisierten Biolkatalysatoren für die Synthese von 2,6-Dichloropurine Ribosid (2,6CP-R) und 6-Chloro-2-Fluoropurine Ribosid (6C2FP-R) wurden Produktausbeuten von 78.5 % bzw. 85.5 % erreicht. 6C2FP-R wurde auf >98% über eine Standard Silizium-Chromatographiesäule aufgereinigt und die Struktur verifiziert. Diese Ergebnisse zeigen das große praktische Potenzial der hier untersuchten Biokatalysatoren. Es ist daher naheliegend, dass einige biologisch wichtige Nucleosid durch das in dieser Arbeit beschriebene Verfahren effizienter als wie bisher in der Literatur beschrieben, hergestellt werden können.Nucleosides represent one class of fundamental building blocks of life systems. Their analogues are extensively used as therapeutic agents for cancer and viral diseases; as precursors of oligonucleotides for therapeutic or diagnostic use; and as molecular tools in research. However, many biologically active nucleosides are difficult to synthesize chemically, which hinders biological trials and studies as well as the application of these compounds. The chemoenzymatic synthesis in comparison to the pure chemical synthesis offers great benefits as a simple, efficient and “green” technology in view of simplicity, costs and yield. The focus of this study was on the application of novel nucleoside phosphorylases (NPs) for the biocatalytic synthesis of nucleoside analogues. The applied enzymes originate from thermophilic microorganisms (Deinococcus geothermalis, Geobacillus thermoglucosidasius, Thermus thermphilus, and Aeropyrum pernix). Five thermostable NPs (TtPyNP, GtPyNP, DgPNP, GtPNP and ApMTAP) were successfully recombinantly expressed in soluble and active form in the Gram-negative bacterium Escherichia coli, and were characterised with respect to temperature optimum, stability, substrate specificity, kinetic behaviour, pH optimum and in view of their similarity by sequence alignments. The results demonstrate their promising biocatalytic properties, especially for TtPyNP and GtPNP, which displayed particularly high catalytic activity towards natural substrates (3-6 times higher than the commonly used enzymes from E. coli) under the experimental conditions. Furthermore, they showed high promiscuity, i.e. they were able to catalyse a broad range of modified substrates. Both enzymes accept nucleosides modified in the sugar moiety, e.g. 2’- or 3’-NH2, 2’-F (ribo- or arabino-) and 2’-OH (arabino); GtPNP recognizes 2,6-Cl or F substituted purine. In coupled reactions with TtPyNP and GtPNP as catalysts various modified purine nucleosides were successfully synthesized. For the synthesis of purine nucleoside analogues, TtPyNP and GtPNP were successfully immobilized on magnetic microsphere beads with high residual enzyme activity, high enzyme loading, and further enhanced enzyme stability. The application of the immobilized enzymes in the synthesis of 2,6-dichloropurine riboside and 6-chloro-2-fluoropurine riboside (6C2FP-R) resulted in product yields of 78.5 % and 85.5 % (HPLC), the latter molecule was isolated and purified ( >98 %) by silica chromatography (normal-phase column) and the compound’s structure was confirmed. These results reveal the great practical potential of the studied biocatalysts. Hence, it is conceivable to produce a number of nucleoside analogues by the described method, which appears more efficient than other synthetic routes described in literature so far