Stabile Silikon-Enzym-Träger-Präparate für die biokatalytische Synthese enantiomerenreiner Produkte

Die vorliegende Studie befasst sich mit der Anwendbarkeit von so genannten silCoat-Präparationen für den Einsatz in wässrigen Medien. In vorangegangenen Arbeiten wurde diese silCoat Technologie auf adsorptiv immobilisierten Lipase-Präparaten angewandt um erhöhte Stabilitäten bei möglichst hohen Restaktivitäten zu erreichen. Die direkte Übernahme dieser silCoat Technologie für die Nutzung in einer wässrigen Phase ist allerdings nicht möglich, aufgrund der erheblichen Diffusionslimitierung hydrophiler Komponenten. Daher wurde innerhalb dieser Doktorarbeit das ursprünglich genutzte Silikon-Materials angepasst, um diese neuartige silCoat Technologie in hydrophile Reaktionssysteme zu übertragen. Durch den Austausch des Silikongrundbausteins Divinyl- Siloxan mit Divinyl -terminierten PEG400, wurde eine deutliche Erhöhung der Hydrophilie des Silikons erreicht, was mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden konnte. Das resultierende Silikonmaterial eignet sich zur Herstellung eines Verbundwerkstoff (HYsilCoat), welcher, wie bei den vorrangegangenen Lipase-Präparaten schon gezeigt werden konnte, deutlich verbesserte Eigenschaften hinsichtlich der mechanische Stabilitäten aufwies. Das entwickelte hydrophilisierte System (HYsilCoat) wurde weiter auf vier verschiedene Dehydrogenasen angewandt, drei Alkoholdehydrogenasen (CPCR2, LBADH, ADH9V1) und einer Aldehyd-Dehydrogenase. Zuvor musste jedoch ein geeignetes Immobilisierungsverfahren gefunden werden, welches ebenso die Nutzung chemische Modifikation beinhaltet, um die HYsilCoat Technologie anzuwenden. Mit der Immobilisierung der untersuchten Dehydrogenasen auf einen Amberlite FPA54 Träger konnten erfolgreich aktive Dehydrogenase-Präparate hergestellt werden. Zusätzlich wurde die Immobilisierung von Escherichia coli (E. coli)-Zellen in dieser Dissertation untersucht. Dabei wurden zwei verschiedene Strategien zur Immobilisierung von E. coli-Zellen mit einer überexprimierten Alkoholdehydrogenase (CPCR2) verwendet, wodurch biokatalytisch aktive Präparate, sowohl in reinem Substrat als auch in wässrigen Lösungen, erreicht werden konnten. Darüber hinaus konnten Beladungsdichten der E. coli-zellen und katalytische Aktivität auf einem Amberlite FPC3500 Träger nachgewiesen werden. Nach der erfolgreichen Entwicklung einer geeigneten Immobilisierungsstrategie wurde das hierin entwickelte HYsilCoat Material auf die Immobilisate von entweder isolierten Enzymen bzw. ganzen Zellen angewandt. Die HYsilCoat Enzympräparate zeichneten sich hierbei durch hohe Restaktivitäten, die durch Optimierung des HYsilCoat-Bildungsprozesses erreicht wurden und durch eine drastische Verringerung des Enzymleachings aus. Darüber hinaus konnte mithilfe der HYsilCoat Technologie eine Möglichkeit zur zusätzlichen Kofaktorimmobilisierung genutzt werden, welche sich mit höheren Gesamtumsatz Zahlen (TTN) bezogen auf den Kofaktor auszeichnete. Des Weiteren wurden die E. coli Immobilisate sowohl für die Produktion von hydrophoben silCoat-Präparaten als auch für die Produktion von HYsilCoat-Präparaten verwendet. Es konnte eindrucksvoll gezeigt werden, dass das Auswaschen (leaching) der Zellen deutlich verringert werden konnte. Darüber hinaus könnte die Lebensfähigkeit der Zellen sowohl nach der Immobilisierung als auch nach Bildung der HYsilCoat-Präparate eindrucksvoll gezeigt werden.The present study deals with the applicability of so called silCoat-preparation for use in aqueous medium. Previous work applied a silicone coating onto adsorptive immobilized lipase preparation for the enhancement of the stability of the biocatalyst. In aqueous medium silCoat technology however showed low catalytic activities due to the significant diffusion limitation. Hence, within the PhD thesis the modification of standard silicone material was explored in order to transfer this novel technology into hydrophilic reaction systems. Successful results could be achieved by replacement of divinyl-terminated siloxane with divinyl-terminated PEG400, leading to an increase in the hydrophilicity of silicone rubbers, which could be proved by different methods. The resulting silicone preparation (HYsilCoat) is suitable for the preparation of a final composite material whereby an additional increase in mechanical stability of the carrier material was also observed. This enhancement was impressive whereby using alumina carrier, as it could be shown for the original material on Novozyme 435. The developed HYsilCoat system was further applied to four different dehydrogenases, three alcohol dehydrogenases (CPCR2, lbADH, ADH9V1) and an aldehyde dehydrogenase. However, prior to the HYsilCoat preparations of the above given enzymes, a proper immobilization method was required including also a proper chemical modification. Successful results could be achieved by immobilization on Amberlite FPA54 carrier, for all investigated enzymes. Additionally the immobilization of Escherichia coli (E. coli) cells was examined during this PhD thesis. Two strategies for immobilization of E. coli cells hosting overexpressed CPCR2 were used which gave biocatalytically active preparations both in neat substrates and in aqueous substrate solution, respectively. Furthermore, tremendous results regarding cell loading and catalytic activity could be achieved using Amberlite FPC3500 carrier. After the development of a suitable immobilization strategy, the herein developed HYsilCoat material was applied to the immolizates either prepared from isolated enzymes or from whole-cells. The HYsilCoat enzyme preparations were successfully developed with high residual activity, which was achieved by optimization of HYsilCoat-formation process parameters. Enzyme leaching was significantly decreased for all enzymes investigated. In addition, using the HYsilCoat-formation the crucial cofactor was also immobilized which gave higher total turnover numbers for the cofactor. Finally, E. coli immobilizates were used for both the standard hydrophobic silicone and the developed HYsilCoat-material. It could be impressively shown that cell leaching was significantly decreased by HYsilCoat-formation. Furthermore, the viability of the cells after immobilization and composite formation could be successfully followed. Here, further work could be done combining the HYsilCoat technology with other whole-cells for fermentative processes, in which the product has to be absolutely cell free