Identifikation neuartiger bakterieller Antigene und Charakterisierung der linearen Epitope

Im Zuge der stets wachsenden Zahl an multiresistenten bakteriellen Pathogenen weltweit bleibt die Suche nach einer zuverlässigen Schnelldiagnostik eine der Hauptaufgaben der klinischen Forschung. Obwohl bereits unterschiedlichste Nachweisverfahren im Umlauf sind, so erscheint ein Schnelltest, welcher die Existenz von artspezifischen Oberflächenantigenen ausnutzt, als eine geeignete Herangehensweise. Leider ist die Kenntnis über das vielschichtige und teils hoch komplexe Repertoire an potentiellen Antigenen aus Bakterien recht begrenzt. Vor diesem Hintergrund sollte eine Methode entwickelt werden, die es ermöglicht, schnell und zuverlässig, neue bisher unbekannte bakterielle Antigene von relevanten humanpathogenen Keimen zu identifizieren. Dazu wurden vier der am häufigsten vorkommenden Erreger verwendet: Campylobacter jejuni, Salmonella enterica, Extended-spectrum-beta-lactamasen (ESBL) Klebsiella pneumoniae und Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA). Zu diesem Zweck sollten aus diesen Bakterien cDNA Bibliotheken generiert und anschließend über immunologische Screenings, schnell und zuverlässig neuartige Antigene aufgedeckt werden. Da die Herstellung von cDNA Bibliotheken aus Bakterien eher selten ist, mussten bestehende Methoden für eukaryontische Zellen abgewandelt, neu entwickelt und adaptiert werden, um den besonderen Anforderungen bakterieller RNA gerecht zu werden. Dabei ist vor allem die Isolierung geringer Mengen bakterieller mRNA aus Gesamt-RNA, welche hauptsächlich aus rRNA gebildet wird, eine der zentralen Herausforderungen. Darüber hinaus besteht die Problematik darin, dass im anschließenden Screening auf Antigene mit polyklonalen Seren oder Antikörpern hauptsächlich kreuzreaktive Signale auftreten, die eine eindeutige Identifikation erschweren. Um dem Einhalt zu gebieten, wurde eine neue Methode entwickelt, die auf Microarrays basiert und einen speziellen Protein-Tag, den HaloTag®. Dieser Tag weist einzigartige Eigenschaften auf und ermöglicht auf Grund seiner irreversiblen, kovalenten Bindung, die hoch spezifisch und selektiv erfolgt, eine direkte Immobilisierung der Zielproteine aus Zelllysaten auf der Oberfläche des Microarrays, ohne eine vorherige Proteinaufreinigung durchführen zu müssen. Das stellt eine signifikante Weiterentwicklung und Verbesserung bestehender Methoden dar, die durch die notwendige Proteinaufreinigung von tausenden Proben zeit- und kostenintensiv sind. Somit wurden Screenings durchgeführt und für alle vier Bakterienarten konnten neue zuvor unbeschriebene Proteine mit immunogenem Verhalten identifiziert werden. Anschließend wurden diese neuen Proteine analysiert und eine Auswahl der vielversprechendsten Kandidaten mittels Epitopkartierung und Alaninaustausch auf das Vorhandensein linearer Epitope untersucht. Durch Analyse der Spezifität der gefundenen Epitope konnten solche isoliert werden, die spezifisch für das jeweilige Bakterium waren. Die experimentellen Daten wurden durch bioinformatische Anwendungen komplettiert. Dadurch war es möglich, die Spezifität der Epitope zu bestätigen sowie die Zugänglichkeit und Anwendbarkeit der identifizierten Epitope zu verifizieren. Durch diesen dualen Ansatz ist die vorgestellte Methode gut geeignet schnell und zuverlässig neue bakterielle Antigene zu identifizieren und zu charakterisieren. Diese geben die Möglichkeit unterschiedlicher Anwendungen. Dazu gehört zum Einen die Entwicklung monoklonaler Antikörper gegen die identifizierten Epitope, welche in einem diagnostischen Testsystem Anwendung finden könnten. Zum Anderen, sind lineare Epitope für die Impfstoffherstellung geeignet. Hinzu kommt, dass zuvor unbeschriebene Proteine, deren Funktion und Struktur teilweise unbekannt ist, die sich aber oftmals an der Bakterienmembran befinden, u.U. neue Virulenzfaktoren darstellen, die bislang nicht aufgeklärt werden konnten. Ein tieferer Einblick in die Funktionsweise von Virulenzfaktoren kann dazu beitragen die Pathogenität und Virulenz dieser Bakterien besser zu verstehen. Abschließend bleibt zu vermerken, dass diese Methode leicht auf andere bakterielle Erreger übertragen werden kann, wie hier anhand von vier relevanten Keimen gezeigt wurde. Somit liefert diese Technik ein einfaches und zuverlässiges Werkzeug für die Enthüllung neuer Antigene.In the wake of continuous spreading of multiple-resistant bacteria causing harm to individuals across the globe, the search for rapid and reliable point-of-care diagnostics remains a dire need. Although different approaches exist, a fast assay relying on the presence of species-specific antigens seems plausible. Still, the knowledge of bacteria's vast spectra of potential antigens is scarce, as only a select few structures have been revealed. In this context, a method was devised to illuminate novel immunogenic proteins of pathogens. As relevant pathogens Campylobacter jejuni, Salmonella enterica, Extended-spectrum-beta-lactamase (ESBL) Klebsiella pneumoniae and Methicillin-resistant Staphylococcus aureus were used, comprising four of the major bacteria causing millions of infections worldwide annually. To achieve this, cDNA libraries were generated. The construction of cDNA libraries has hardly been done with bacterial transcriptomes, thus existing methods had to be revamped, optimized and adapted to suit the unique characteristics of prokaryotic RNA. Predominantly, the isolation of minute amounts of mRNA within a total RNA bristling with rRNA was a major challenge. Furthermore, after successful library construction, one main issue with immunoscreening of bacterial expression libraries is the paramount cross-reactivity when using polyclonal antibodies. Thus, a novel screening approach was constructed using microarrays and a specific protein tag, HaloTag®. This tag features irreversible, covalent, highly specific and selective binding allowing to directly immobilize the proteins of interest on the microarray surface without the need of prior purification. This is a significant upgrade over previously used methods, as protein purification of hundreds and thousands of samples in parallel is labor-intensive and costly. Consequently, immunoscreenings were performed on different libraries comprising the four pathogens mentioned and several proteins were revealed which had not been shown to be immunogenic before. Further analyses and characterization led to a small subset of proteins deemed most likely to be specific. In turn, linear epitope mapping and subsequent alanine scan helped to illuminate linear epitopes within these proteins. While not all proved to be specific, a number of linear epitopes showed both specificity in the experimental stage as well as in bioinformatic assessment through alignments. Moreover, the accessibility and suitability of the identified epitopes was examined by several well established bioinformatic tools and algorithms. Hence, this dual approach quickly delivers hard experimental facts with the strong support of software prediction. Therefore, the present work is effective in quickly revealing novel bacterial antigens that can be used for a number of future applications. First, generation of monoclonal antibodies to the revealed targets and subsequent utilization of these within a point-of-care tool is worth pursuing. Secondly, specific linear epitopes might be well suitable for vaccine development. Finally, revelation of previously unknown and uncharacterized proteins showing a strong immunogenicity and association with the outer membrane might unveil novel virulence-factors to gain insight into the bacteria's pathogenicity and virulence. Last but not least, this technique is readily transferred to other bacterial pathogens of relevance as the investigation using four different kinds has shown. Thanks to a quick turn-around time, identification of novel antigens starting from a pathogen of interest can be achieved in a few weeks. Conclusively, this provides researchers with an easy-to-handle and reliable tool in antigen illumination