Simulation der Knochenmark-Mikroumgebung

Hämatopoetische Stammzellen (HSC) sind nicht nur wegen der allogenen Transplatationstherapie von großer Bedeutung, sondern zeichnen sich auch als Paradigma für adulte multipotente Stammzellen mit Fähigkeit zur Selbsterneuerung aus. Die Zellen persistieren dabei in einer Stammzellnische, welche ein physiologisches Milieu zum Erhalt des Stammzellphenotyps bereitstellt. Die molekularen und zellulären Mechanismen, welche über das Schicksal der HSCs innerhalb der Nische entscheiden, sind aber aufgrund des Fehlens eines geeigneten in vitro Modells noch weitgehend unbekannt. Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung und Charakterisierung eines neuartigen 3D Kulturmodells bestehend aus einer porösen Hydroxyapatit beschichteten Keramik, welche mit aus dem Knochenmark isolierten mesenchymalen Stammzellen und aus dem Nabelschnurblut aufgereinigten Hämatopoetischen Stammzellen besiedelt wird. Damit bietet diese 3D Kulturmodell das Potential zur Beschreibung zellulärer Interaktionen innerhalb der Hämatopoetischen Stammzellnische. Aufgrund der Kultivierung in den Keramiken generierten die Mesenchymalen Stammzellen eine knochenmarkähnliche Umgebung. Neben einer starken Ähnlichkeit zu humanen Knochenmarksstrukturen, zeichnet sich diese durch die Expression typischer Vertreter extrazellulärer Matrixproteine des Knochenmarks wie beispielsweise Fibronectin oder Collagen Typ I aber auch Marker der osteogenen Differenzierung aus. Ein Vergleich des Keramik-3D-Kulturmodells mit herkömmlichen HSPC Kultivierungsstrategien unter den Aspekten des Erhalts des Stammzellphenotyps, der Vitalität und Funktionalität zeigte, dass nur das Keramik-Kultur-System für die Langzeitkultivierung (8 Wochen) der HSPC bei gleichzeitiger Erhaltung des Stammzellphenotyps (CD34+ CD38-) geeignet war. Das ist die bisher längste Kultivierung Hämatopoetischer Stammzellen in vitro. Die Zellen zeigten ein langsames Proliferationsverhalten als auch ein für HSCs typisches Differenzierungspotential. Untersuchungen der Mikroumgebung innerhalb der Keramik im Bezug auf Struktur, extrazelluläre Matrix und die Expression Homeostase relevanter Signalmoleküle zeigte eine starke Ähnlichkeit zu den Gegebenheiten des Knochenmarks. Dabei interagierten die Hämatopoetischen Stammzellen sowohl mit der neu generierten Matrix als auch mit den MSCs. Das System stellt somit nicht nur ein Langzeitkultivierungsmodell für Hämatopoetische Stammzellen dar, sondern ist ebenfalls sehr gut für weitere Untersuchungen zellulärer und molekularer Interaktion innerhalb der Knochenmarksstammzellniche geeignet.HSPC maintenance, phenotype, viability and functionality in this system were Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) are of immense significance, not only due to their use in traditional allogenic transplantation therapy, but also as a paradigm for adult stem cells capable of self-renewal as well as multi-potent differentiation. It is well established that the physiological microenvironment or ‘niche’ in which these cells reside is vital for their maintenance. The molecular and cellular mechanisms governing HSPC fate decisions however are yet to elucidated, largely due to the lack of a suitable in-vitro model. Here, we present and characterize a novel 3D co-culture system comprising bone marrow mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) and cord blood derived HSPCs, within a porous hydroxyapatite-coated ceramic scaffold, as a model for the main cellular interactions within the bone marrow HSPC niche. Characterization of the 3D culture system revealed that MSCs spontaneously produce a bone marrow-like environment, when cultured in the ceramic scaffolds. Apart from physical resemblance to bone marrow, extracellular matrix molecules typically found in the bone marrow HSPC niche including fibronectin and collagen I were found to be produced. The MSCs also exhibit spontaneous osteogenic differentiation within 1 week of culture in the ceramic. HSPC maintenance, phenotype, viability and functionality in this system were compared with traditional HSPC expansion and maintenance strategies. We were able to achieve stable long-term (8-week) maintenance of primitive HSPCs (CD34+ CD38-) only in the 3D system. This is the longest time period of in vitro HSPC maintenance described to date. These cells were found to be slow proliferating, viable and capable of GEMM colony formation, which is characteristic of long-term repopulating HSPCs. Furthermore, the microenvironment within the ceramic bears close structural resemblance to that of bone marrow, and contains ECM and signaling molecules known to play a role in HSPC homeostasis. The HSPCs were shown to interact with these molecules as well as with the MSCs in the ceramic. This co-culture system, therefore, not only presents a new means of HSPC maintenance, but also a medium to study the cellular and molecular interactions involved in niche homeostasis