Expressionsbibliotheken als Werkzeuge für die Entwicklung von Subunit-Impfstoffen und neuartigen Detektionsmolekülen für Orthopockenviren

Nach der erfolgreichen globalen Ausrottung der Pockenkrankheit wurde die Pockenimpfung aufgrund seltener aber schwerer Komplikationen eingestellt. Heute, nach mehr als 30 Jahren, weist die Mehrheit der Welt-Bevölkerung keinen Immunschutz mehr auf. Gleichzeitig steigt neben der Häufigkeit zoonotischer Pockenvirusinfektionen mit Affen- oder Kuhpockenviren auch die Angst vor Bioterror-Anschlägen mit Variolaviren. Diese Entwicklungen unterstreichen die Notwendigkeit von Projekten, die vorbereitende Maßnahmen für den Fall eines Bioterroranschlags treffen, um die Ausbreitung von Krankheitserregern zu verhindern. Hierzu zählt neben der Entwicklung von schnellen und einfach zu bedienenden Diagnostikplattformen auch die Verfügbarkeit von Impfstoffen und Therapeutika, die der Mehrheit der Bevölkerung verabreicht werden können. Obwohl bereits zahlreiche, gut etablierte Methoden für den Nachweis von Pockenviren existieren, sind diese für eine schnelle Vor-Ort-Diagnostik häufig nicht geeignet. Vorhandene konventionelle Pockenimpfstoffe besitzen gute immunogene Eigenschaften, können jedoch einer steigenden Anzahl immunsupprimierter Menschen nicht verabreicht werden. Somit ist eine Entwicklung sicherer Pockenimpfstoffe erforderlich. Hierbei, stellen Subunit-Impfstoffe eine potentiell sicherere Alternative zu konventionellen Impfstoffen dar. Um die Entwicklung von Subunit-Impfstoffen voranzubringen und die Anwendbarkeit synthetischer Peptid-Aptamere für Pockenvirusdetektion zu beurteilen, wurden in der vorliegenden Arbeit Bakteriophagen-basierte Bibliotheken gescreent. Zuerst wurde eine kostengünstige Methode zur Antigen-Identifizierung etabliert und evaluiert. Bei dieser Methode werden Bakteriophagen-basierte Expressionsbibliotheken mit Pocken-Antiseren gescreent. Dank dieser serologischen Screenings konnten 21 immunogene Pockenproteine identifiziert werden. Sechzehn dieser 21 Proteine wurden auch als kreuzreaktiv zwischen Vaccinia-Virus und Kuhpockenvirus identifiziert. Nach einer Auswertung, werden sieben der identifizierten kreuzreaktiven Proteine A3, A4, D13, E2, E3, E9 und H6 aufgrund ihrer Antigenität und Konserviertheit für die Verwendung in Subunit-Impfstoffen vorgeschlagen. Außerdem wird die kombinatorische Phagen-Display-Methode und ihre Verwendung zur Identifizierung pockenspezifischer Peptidliganden als neuartige Detektionsmoleküle vorgestellt. Affinitätsselektionen von Phagen-Display-Bibliotheken gegen infektiöse Vaccinia-Virus-Partikel führten zur erfolgreichen Anreicherung von 17 wiederkehrenden Peptidsequenzen, was auf eine Anreicherung von Pockenvirus-bindenden Phagenklonen hindeutet. Nach einer Charakterisierung dieser 17 bindenden Klone, wurden drei Peptidsequenzen ausgewählt, synthetisiert und weiter charakterisiert. Dabei konnte für eins dieser drei synthetischen Peptide eine spezifische Bindung an Vaccinia-Virus-Partikel gezeigt werden. Dies demonstriert die Eignung synthetischer Peptide für die Detektion von Bioterror-Agenzien.The global eradication of smallpox led to the cessation of routine smallpox vaccination due to rare but severe adverse reactions. Today, more than 30 years later, the majority of the world’s population has no protective immunity against poxviruses. Concurrently, the frequency of zoonotic poxvirus infections with monkeypox and cowpox virus is increasing, accompanied by the fear of bioterrorist attacks with smallpox. These developments emphasize the need for bio-preparedness programs to enable rapid and effective prevention and control of poxvirus-associated disease spread. Bio-preparedness includes the availability of rapid detection methods as well as the existence of safe vaccines and therapeutics that can be administered to the majority of the population. Various existing poxvirus detection methods are well-established and highly sensitive. However, they are usually not suitable for rapid on-site detection of biothreat agents. Conventional smallpox vaccines, on the other hand, show excellent immunogenic properties. Yet today, they can not be administered to a growing proportion of individuals with impaired immunity, urging the development of safer vaccines. Thereby, recombinant subunit vaccines are considered to be a safer alternative to conventional smallpox vaccines. To speed up the development of subunit vaccines and to evaluate the applicability of synthetic peptide aptamers for poxvirus detection, screenings of bacteriophage-based libraries were utilized in the present study. First, a low-cost approach for antigen discovery was established and evaluated. This approach is based on serological screenings of bacteriophage-based genomic expression libraries. These screenings resulted in the identification of 21 antigenic proteins. Sixteen of these 21 antigens were also found to be cross-reactive among cowpox and vaccinia virus. In addition, seven of identified antigenic cross-reactive proteins A3, A4, D13, E2, E3, E9, and H6 are proposed to be included in subunit vaccines due to their antigenicity and conservation among orthopoxviruses. Additionally, combinatorial phage display methodology was utilized to identify poxvirus-specific peptide ligands as novel detection molecules. Affinity selections of random peptide phage display libraries against infectious virus particles yielded 17 recurring peptide sequences indicating an enrichment of poxvirus-binding phage clones. After characterization of these 17 binding clones, three peptide sequences were synthesized and characterized further. Thereby, one phage-derived synthetic peptide was shown to bind selectively and specifically to vaccinia virus particles. This provides important insights into applicability of synthetic molecules for detection of biothreat agents