Entwicklung von immoblilisierten Biokatalysatoren mit verbesserten Grenzflächeneigenschaften für die Anwendung in der Organischen Synthese

Die Biokatalyse in organischen Lösunsgmitteln unter Verwendung immobilisierter Enzyme hat in den letzten Jahrzehnten eine enorme Bedeutung für die chemische und pharmazeutische Synthese erlangt. In technischen Anwendungen ist ihr Erfolg jedoch oft durch Stofftransferlimitierungen während der Reaktionen beeinträchtigt. Diese Einschränkungen variieren mit unterschiedlichen Trägern, ein gemeinsames Merkmal ist jedoch die Ausbildung einer geringen Grenzfläche zwischen dem Träger, der Enzymphase oder dem Reaktionsmedium, was die katalytische Effizienz stark reduziert. Aus diesem Grund ist die Verbesserung der Grenzfläche entscheidend, um die biokatalytische Leistung von immobilisierten Enzymen in organischen Lösungsmitteln zu erhöhen. In dieser Arbeit wurden drei vielversprechende Träger (hydrophile Agargele, hydrophobe Siliconperlen und Pickering-Emulsionen) als Gegenstand einer repräsentativen Studie ausgewählt. Verschiedene Strategien wurden dabei zur Verbesserung der geringen Grenzflächen dieser Träger verwendet. Üblicherweise wurden hydrophile Agargele durch das Eintropfen einer flüssigen Agarlösung in Hexan erhalten. Hydrophobe Siliconperlen wurden durch Suspensionspolymerisation hergestellt, das heißt, durch Eintauchen hydrophober Siliconvorstufen in Polyvinylalkohol (PVA)-Lösungen unter ständigem Rühren. Pickering-Emulsionen wurden durch Silicat-Nanopartikel stabilisiert. Diese Träger wurden dazu verwendet, verschiedene Enzyme, einschließlich der Lipase A und B aus Candida antarctica (CalA und CalB) und der Benzaldehydlyase aus Pseudomonas fluorescens (BAL) zu immobilisieren. Die Veresterung von Octanol und Octansäure diente der Bestimmung der Lipase-Aktivität. Die Benzoinkondensation wurde als BAL-katalysierte Reaktion eingesetzt. Für jede Reaktion wurden entsprechend der Literaturangaben optimale Reaktionsbedingungen eingesetzt. Die gaschromatographische Analyse diente der Bestimmung der Substrate und Produkte zur Berechnung der Enzymaktivität und des Reaktionsumsatzes. Für hydrophile Agargele wurde ein Lösungsmittelaustauschverfahren verwendet, um die Löslichkeit von Agargelen, die mit CAlB beladen waren, in der organischen Phase zu verbessern. Mit diesem Ansatz wurde die CalB mit Fluoreszenz-Farbstoff markiert und in die Kerne von Agargelen übertragen. Dies deutete darauf hin, dass anhand dieser Methode, die Oberfläche des hydrophilen Gels benetzt werden kann und Enzyme in den Gelkernen konzentriert werden können, um eine Lösunsgmittelinaktivierung zu vermeiden. Zudem konnte die Stabilität und Wiederverwendbarkeit der immobilisierten CalB nach Austausch des Lösungsmittels im Vergleich zum nativen Enzym verbessert werden. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass das Lösungsmittelaustauschverfahren eine gute Methode darstellt, um die Löslichkeit von hydrophilen Trägern in organischen Lösungsmitteln und somit deren Oberfläche für die Katalyse zu verbessern. Für hydrophobe Träger wurde die CalA in biokatalytisch aktiven Siliconperlen (BASE) eingeschlossen, in denen die wässrige Enzymlösung in Form zahlreicher Mikroeinsätze emulgiert wurde. Anhand von Berechnungen besitzen diese Mikroeinsätze eine große Fläche, die mehr das als 300-fache einer Sphäre in flüssiger Form beträgt. Basierend auf diesen Berechnungen wurde eine Optimierung dieser Siliconperlen für die Katalyse durchgeführt, um die wässrige Enzymphase in Silicon weiter zu vergrößern. Interessanterweise führte ein größeres Volumen der wässrigen Phase der Siliconperlen zu einer Vergrößerung der Anzahl und Verringerung der Größe der Mikroporen. Dies hatte eine Erhöhung der enzymatischen Aktivität zur Folge. Die optimale Zusammensetzung der Siliconperlen betrug 8,8 g Silicon und 5 mL Enzymlösung. Anschließend wurde eine weitere Optimierung des Wassergehaltes bei dem definierten Verhältnis von Silicon (g) und der wässrigen Phase (mL) durchgeführt. Darüber hinaus wurde die Stofftransferlimitierung über den Verlauf der Penetration von eingefärbtem Heptan in die Siliconperlen beurteilt. Durch diese Studien konnte die Schnittstelle des hydrophoben Silicon-Trägers durch Optimierung hinsichtlich der Zusammensetzung und des Wassergehaltes für die Biokatalyse verbessert werden. Für Pickering-Emulsionen wurden Silicat-Nanopartikel verwendet, um die CalB bzw. die BAL zu verkapseln. Überraschenderweise zeigte die Bewertung der beiden Enzymaktivitäten eine 300-fach erhöhte Aktivität für die CalB und eine 8-fach erhöhte Aktivität für die BAL. Dieses Ergebnis zeigt, dass Pickering-Emulsionen ein gutes System für stabile Enzyme wie die CalB und anfällige wie die BAL darstellen. Die erhöhte Aktivität von Enzymen in Pickering-Emulsionen lässt sich auf die große Oberfläche dieser Emulsionen in der organischen Phase zurückführen. Im Rahmen Untersuchungen wurden Agargele, Siliconperlen und Pickering-Emulsionen gezielt als Träger ausgewählt, um Enzyme für die Biokatalyse in organischen Medien zu immobilisieren. Es wurden verschiedene Strategien angewendet, um die Löslichkeit von Agargelen in Lösungsmitteln zu verbessern und die Grenzfläche der wässrigen Enzymphase innerhalb der Siliconperlen zu vergrößern sowie eine große Oberfläche von Pickering-Emulsionen in organischen Lösungsmitteln zu erzielen. Mit diesen Ergebnissen für die drei Träger wurde ein Beitrag zur Verbesserung der Grenzfläche verschiedener Immobilisierungsmatrizen für die Biokatalyse in organischen Medien geleistet.Biocatalysis by immobilized enzymes in organic solvent media has achieved tremendous importance for chemical and pharmaceutical synthesis within the last number of decades. However, in practical applications, their success is often compromised by serious mass transfer limitations during reactions. Limitations vary with different carriers, but a common feature is the formation of a poor interface between carriers, enzyme phase or reaction media, which greatly reduces the catalytic efficiency. Thus, improving the interface is crucial to enhance the biocatalytic performance of immobilized enzymes in organic solvents. In this thesis, three promising carriers (hydrophilic agar gels, hydrophobic silicone beads, and Pickering emulsions) were selected as representative study objects. Different strategies were employed to improve the poor interface of these carriers. Typically, hydrophilic agar gels were obtained by dropping liquid agar solutions into hexane. Hydrophobic silicone beads were produced through suspension polymerization, i.e. by immersing hydrophobic silicone precursors in polyvinyl alcohol (PVA) solutions with constant stirring. Pickering emulsions were stabilized by silica nanoparticles. These carriers were used to immobilize different enzymes including lipase A and B from Candida antarctica and benzaldehyde lyase (BAL) from Pseudomonas fluorescens. Esterification of octanol and octanoic acid was performed to assess lipase activity. Benzoin condensation was employed for BAL catalyzed reaction. Optimal reaction conditions were set up for each reaction as literature. Gas chromatography (GC) was used to determine substrates and products for calculation of enzyme activity and reaction conversion. For hydrophilic agar gels, a solvent exchange process was used to improve the solubility of agar gels loaded with lipase B from Candida antarctica (CalB) in organic phase. By this approach, CalB labeled with fluorescence dye was transfered into cores of agar gels. This indicates that this method is able to wet the surface of hydrophilic gels and to concentrate enzymes into the gel cores to avoid solvent inactivation. It was also found that the stability and reusability of immobilized CalB were improved after the solvent exchange, compared to native enzymes. These results illustrate that the solvent exchange process is a good method to improve the solubility of hydrophilic carriers in organic solvents, thus improving their interface for catalysis. For hydrophobic carriers, lipase A from Candida antarctica (CalA) was entrapped in biocatalytic active silicone beads (BASE), in which the aqueous enzyme solution was emulsified as numerous micro-pools. By calculation, these micro-pools have a large surface area, more than 300 times larger than they form as one sphere of liquid. Encouraged by this calculation, optimization of these silicone beads for catalysis was executed to further increase aqueous enzyme phase in silicone. Interestingly, a larger volume of aqueous phase in silicone beads resulted in a greater number of smaller micro-pools, which contributed to an even higher apparent activity of silicone beads. An optimal composition of the silicone beads consists of 8.8 g silicone and 5 mL enzyme solutions. Afterwards the water content in the defined ratio of silicone (g) to aqueous phase (mL) was further optimized. In addition, mass transfer limitation was assessed by penetration progression of dyed heptane in silicone beads. Thus through these studies, the interface of the hydrophobic silicone carriers was improved by optimizing them in terms of composition and water content for biocatalysis. For Pickering emulsions, silica nanoparticles were used to encapsulate CalB and BAL, respectively. Surprisingly, assessment of the two enzyme activity revealed that CalB activity had increased more than 300 times, and BAL activity had enhanced 8 times. These results demonstrate that Pickering emulsions are a good system for both stable enzymes like CalB and susceptible ones like BAL. The enhanced activity of enzymes in Pickering emulsions is due to the large interface of these emulsions in organic phase. During research, agar gels, silicone beads, and Pickering emulsions are selected as targeted carriers to immobilize enzymes for biocatalysis in organic media. Different strategies were used to improve the solubility of agar gels in solvents, and to extend the interfacial area of aqueous enzyme phase within the silicone beads, and to produce large surface area of Pickering emulsions in organic solvents. With these findings in three carriers, the contributions to improve the interface of diverse immobilization matrices for biocatalysis in organic media were demonstrated