Untersuchung reifer Biofilmpopulationen in der Trinkwasserverteilung unter besonderer Berücksichtigung hygienisch relevanter Bakterien

In der vorliegenden Arbeit wurden reife Biofilme in Reaktorsystemen und Rohren aus dem Trinkwasserverteilungssystem untersucht. Das Ziel der Arbeit war die Beschreibung der mikrobiellen Gemeinschaft mit dem Schwerpunkt auf Bakterien mit hygienischer Bedeutung. In den Reaktorsystemen in Berlin und dem Ruhrgebiet entwickelten sich Biofilme 6 bis 24 Monate (mittleres Alter) auf Glas, Kupfer, PE, Edelstahl und PVC. Der experimentelle Aufbau und Betrieb des Systems zeigte Bedingungen wie sie im Trinkwasserverteilungssystem und in der Hausinstallation herrschen. Zusätzlich wurde in einem Kooperationsprojekt mit der DTU, Lyngby in Dänemark, ein weiteres Reaktorsystem untersucht. Die Untersuchung der Trinkwasserrohre aus dem Verteilungssystem beschränkte sich auf die Materialien Gusseisen, Grauguss, mit Zement ausgekleidete gusseiserne Rohre sowie Rohre aus den Materialien PE und PVC. Es wurden insgesamt 454 Bakterien aus den Biofilmproben isoliert. Diese wurden durch Sequenzierung oder eine Kombination aus RFLP und Sequenzierung phylogenetisch zugeordnet. Die aus den Biofilmen des deutschen und dänischen Reaktors gewonnenen kultivierbaren Bakterien wurden den Phyla Firmicutes, Bacteroidetes und zu einem großen Anteil den Proteobakterien (79 %) zugeordnet. Es wurden nur zwei gram-positive Bakterien der Gattung Bacillus und vier Flavobacteriaceae identifiziert. Im Gegensatz dazu wurden in den alten Biofilmen der Rohre annähernd so viele gram-positive (49 %) wie gram-negative (51 %) Bakterien gefunden. Es wurden einige Gattungen mit pathogenem Potential identifiziert. Diese wurden jedoch nicht auf das Vorhandensein von Virulenzfaktoren oder ihr Infektionspotential überprüft. In der Freiwasserphase der Reaktorsysteme wurden die Gattungen Acinetobacter, Aeromonas sowie P. aeruginosa gefunden. Zusätzlich wurden im Berliner Reaktorsystem die Gattung Aeromonas und in den Rohrproben Mykobakterien nachgewiesen. Die Gesamtzellzahlen in den Biofilmen mittleren Alters auf Glas, PE, PVC, Kupfer und Stahl zeigten eine Näherung über die Zeit. Dieser Effekt wurde auf einen geringen Einfluss des Materials auf das Wachstum der Biofilme zurückgeführt. Im Gegensatz dazu zeigte der alkalische pH-Wert der Zementproben einen lang anhaltenden Effekt auf die Gesamtzellzahlen in den alten Biofilmen. Das Abschaben und Homogenisieren der Biofilme (mittleres Alter) führte zu einer Reduktion der Gesamtzellzahl. Die statistische Analyse erlaubte es eine Rangfolge der Anzahl der koloniebildenden Einheiten auf den eingesetzten Medien zu erstellen: R2A+Stärke > R2A+Tween > GDWR 20°C and 36°C. Weiter konnte gezeigt werden, dass Standard R2A und modifiziertes R2A in der Lage sind quantitative Unterschiede in der Anzahl der koloniebildenden Einheiten in den alten Biofilmen unterschiedlicher Materialien aufzuzeigen (metallische Materialien, PVC, Zement). Es konnte eine signifikante Korrelation zwischen Standard R2A und modifiziertem R2A festgestellt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Einschränkung der Anwendbarkeit ausgewählter molekularbiologische Methoden auf die reifen Trinkwasserbiofilme gezeigt. Der Nachweis der bakteriellen DNA wurde durch Adsorption und/oder Hemmung der PCR durch die Biofilmextrakte verhindert. Darüber hinaus konnte weder durch verschiedene kommerziell vertriebene Säulenaufreinigungssysteme noch durch die klassische Phenol/Chloroform Extraktion bakterielle DNA in amplifizierbarer Form erhalten werden. Bezogen auf das Gesundheitsrisiko für den Verbraucher kann zusammenfassend gesagt werden, dass je nach Umweltbedingungen ein pathogenes Potential vorliegt. Es besteht jedoch kein akutes Risiko.In the present study, mature drinking water biofilms were investigated in reactor systems and distribution pipes. The aim of the study was to characterize the microbial community with emphasis on bacteria of hygienic relevance. In the reactor in Berlin and the Ruhrgebiet middle aged biofilms (6 to 24 months exposed) were grown on coupons of the materials glass, copper, PE, stainless steel, and PVC. The experimental setup takes place in between the actual distribution system and inhouse installations. In addition, biofilms of another reactor system were investigated by cooperation with the DTU in Lyngby, Denmark. Furthermore, pipe biofilms were obtained from pipes cut out of the actual drinking water distribution system. The investigations of the pipes focussed on the materials cast iron, grey cast iron, and cement lined cast iron as well as PE and PVC. Investigation of the culturable population in biofilm samples revealed 454 isolates in total and were phylogenetically analysed by sequencing or a combined RFLP-sequencing approach. The culturable bacteria from the biofilms of the German and Danish reactor systems clustered in the phyla Firmicutes, Bacteroidetes, and predominately Proteobacteria (79 %). Only two gram-positive Bacillus and four Flavobacteriaceae were identified. In contrast to this, in the old biofilm samples nearly as much gram-positive (49 %) as gram-negative (51 %) bacteria were found. Some genera with pathogenic potential were identified but not tested for virulence factors or infectivity. In the bulk water phase of the reactor systems the genera Acinetobacter, Aeromonas and P. aeruginosa were found. Additionally, in the biofilms of the Berlin reactor system Aeromonas and in the pipes Mycobacterium was detected. Detection of total cell counts in the middle aged biofilms on glass, PE, PVC, copper, and steel showed an approximation with increased exposition times. This effect is related to less impact of the materials to growth of the middle aged biofilms. In contrast to this is the long lasting effect of the alkalinity of cement to total cell counts of the old biofilms. Moreover, it was shown that scraping and homogenization of coupon biofilms reduced total cell counts. The statistical analysis of heterotrophic plate counts of old biofilms resulted in a ranking of colony forming units on the used media and incubation conditions: R2A+starch > R2A+Tween > GDWR 20°C and 36°C. Furthermore, standard R2A and modified R2A are able to detect quantitative differences in colony forming units between the metallic materials, PVC, and cement of the old biofilms. A significant correlation was found between standard R2A and modified R2A. The results of this study showed limitations of selected molecular techniques in mature drinking water biofilms. Detection of bacterial DNA was hindered by adsorption of DNA and/or inhibition of PCR by the biofilm extracts. Moreover, neither the different commercially available column systems nor the traditional phenol/chloroform extraction were able to supply bacterial DNA detectable by PCR out of selected biofilm samples. Regarding the health risk of consumers the results of this study allow the conclusion that there is a pathogenic potential depending on the environmental parameters but no acute risk