Gepulste elektrische Felder - Einfluss auf Physiologie, Struktur und Extraktionsprozesse bei der fettbildenden Hefe Waltomyces lipofer

Im Rahmen der Arbeit wurde der Einfluss der Hochspanungsimpulsbehandlung (HSI) auf die fettbildende Hefe Waltomyces lipofer untersucht. Der Schwerpunkt wurde auf die Extraktion von Proteinen und Fettsäuren sowie auf die Entwicklung dafür geeigneter Prozessstrategien gelegt. Als Grundlage wurden Methoden zur schnellen Überwachung von Vitalität und Fetttropfenbildung etabliert, das Medium optimiert, das Wachstumsverhalten dokumentiert und der Einfluss von HSI auf die Struktur und die Physologie von W.lipofer untersucht. Darüber hinaus wurde an Stelle der Anwendung von HSI auch eine Ultraschallbehandlung durchgeführt. Es wurde getestet, ob mit der Verwendung von Mikroorganismen, energiesparenden Behandlungstechnologien und dem Verzicht auf organische Lösungsmittel nachhaltige und umweltfreundliche Extraktionsprozesse entwickelt werden können. Durch die Verwendung von Mikroorganismen kann das gewünschte Produkt in großen Mengen produziert werden ohne auf natürliche Ressourcen, wie z.B. Fisch oder einige Ölsaaten, zurückgreifen zu müssen. Methoden zur schnellen Überwachung von Vitalität, Zellgröße und der Fettropfenbidung mittels Durchflusszytomerie und -partikelbildanalyse (Flow particle image analysis - FPIA) wurden erfolgreich etabliert oder angepasst. Durch die durchgeführte Wachstumsüberwachung konnte eine maximale optische Dichte von 21.8, eine Verdopplungszeit von 7.1 h, eine über den Wachstumszeitraum leicht abnehmende aber konstant über 96.5 % liegende Vitalität und eine konstante Akkumulation von Fetttropfen, beginnend mit der späten exponentiellen Phase, festgestellt werden. Darüber hinaus konnte ein Zusammenhang zwischen Zellgröße, Fetttropfenbildung, pH-Wert und der Wachstumsrate von W.lipofer gezeigt werden. Der Einfluss der HSI Behandlung auf die Physiologie und auf Extraktionsprozesse wurde untersucht. Die kritische Feldstärke wurde auf 2-3.75 kV/cm ermittelt. In Abhängigkeit von den Behandlungsbedingungen wurde ein starker Einfluss auf die Vitalität, die Zellgröße und die strukturelle Integrität gezeigt. Bei einer elektrischen Feldstärke von 3.75 kV/cm wurde eine konstante Abnahme der Vitaltität und der Zellgröße mit steigendem Energieeintrag festgestellt (1-15 kJ/kg). Bei geringerer elektrischer Feldstärke (2 kV/cm) wurde kein Einfluss auf Vitalität und Zellgröße beobachtet. Hingegen wurde bei 25 kV/cm bereits beim geringsten angewendeten Energieeintrag (d.h. 1 kJ/kg) eine maximale Abnahme der beiden Parameter festgestellt. Die Zusammensetzung der Fettsäuren veränderte sich durch die HSI Behandlung nicht. In unbehandelten und HSI-behandelten Proben waren die vorherrschenden Fettsäuren C16, C18 und C18:1 sowie kleinere Mengen an C16:1, C18:2, C18:3, C22 und C24. Im Bezug auf Extraktionsprozesse, konnte eine erleichterte Extraktion von hydrophilen Substanzen z.B. Proteinen (22.1 % des Gesamtproteins bei 10 kV/cm, 10 kJ/kg) und DNA (70.9 % der Gesamt DNA bei 5 kV/cm, 10 kJ/kg) gezeigt werden. Darüber hinaus wurde demonstriert, dass die HSI Behandlung für die erleichterte mechanische Entwässerung von Zellen eingesetzt werden kann. Die Trockenmasse konnte von 21.7 % in unbehandelten Proben auf 26.6 % bei 5 kV/cm und 15 kJ/kg gesteigert werden. Bei der Extraktion von Lipiden mit dem Neutrallipid Miglyol(R)812 konnten keine signifikanten Extraktionsausbeuten nach HSI Vorbehandlung gezeigt werden. Es wurden sowohl batch als auch kontinuierliche Behandlungsmethoden eingesetzt und die elektrische Feldstärke (0-25 kV/cm) und der Energieeintrag variiert (0-30 kJ/kg). Durch den Einsatz von Ultraschallbehandlung an Stelle von HSI konnten 29.2 % der gesamten Lipide bei einem Energieeintrag von 25 kJ/kg extrahiert werden. Durch die Anwendung von HSI Behandlung und anschließender schonender Trocknung bei 60°C wurde eine erleichterte mechanische Entwässerung und ein beschleunigter Trocknungsprozess beobachtet, während keine negativen Einflüsse der Trocknung auf die Fettsäurezusammensetzung gezeigt werden konnten. Im Rahmen der Arbeit wurden zwei Systeme getestet, die eine Integration der HSI Behandlung in bestehende Fermentationskonzepte erlauben. Solange die gewünschten Behandlungsbedingungen bei gleichzeitigem Erhalt einer hohen Restvitalität möglich sind, bietet sich ein kontinuierliches Behandlungskonzept an. Es konnte gezeigt werden, dass die Zellen nicht an wiederholte HSI Behandlung adaptieren. In diesem Fall sank die Vitalität nie unter 63 % nach HSI Behandlung bei 1.5 kV/cm und 2.8 kJ/kg. Über einen Zeitraum von 4 Tagen, wurden in 24 h Abständen Behandlungen durchgeführt. Sobald die gewählten HSI Behandlungsparameter keine ausreichende Restvitalität für weiteres Wachstum im Fermenter erlauben, kann ein semi-kontinuierliches fed-batch System eingesetzt werden. Durch die Entnahme von Zellmaterial und das direkte Nachfüllen mit frischem Medium wurde die Vitalität von W.lipofer nicht stark beeinflusst und lag in allen Proben über 88 %.The main aim of this thesis was the investigation of pulsed electric field (PEF) treatment effects on the oleaginous yeast Waltomyces lipofer. The focus was laid on the application of PEF treatment on the extraction of proteins and fatty acids as well as on the development of suitable processing strategies. The basis for these investigations was provided by experiments aiming on the development of methods for rapid vitality and lipid droplet measurement, media optimization, growth monitoring as well as investigations on the influence of PEF on the structure and physiology of W.lipofer. Moreover, alternative processing strategies including the use of ultra sound in stead of PEF treatment were applied. Extraction processes were tested, which are sustainable and environmental friendly by using microorganisms, energy saving treatment technologies and an extraction without organic solvents. By using microorganisms, the desired product can be produced in large amounts independent from natural resources, such as fish oils or oil seeds. Rapid methods for flow cytometry and flow particle image analysis (FPIA) for the monitoring of vitality, cell size and lipid droplet development were successfully developed or adapted. Growth monitoring revealed a maximum optical density of 21.8, a doubling time of 7.1 h, a slightly decreasing vitality, which was always above 96.5 %, and a constant accumulation of lipid droplets starting with late exponential phase was determined. Moreover, a correlation between the cell size of W.lipofer, the lipid droplet development, the pH and the growth rate was demonstrated. The influence of PEF on the physiology as well as on extraction processes was analyzed. A critical field strength of 2-3.75 kV/cm was determined. Depending on the treatment conditions a strong impact on vitality, cell size and structural integrity of the yeast cells was observed. At 3.75 kV/cm a constant decrease of vitality and cell size was seen with increasing energy input (1-15 kJ/kg). At a low electric field strength no influence on cell size and vitality was observed, while at a high electric field strength, i.e. 25 kV/cm, even the lowest energy input used, i.e. 1 kJ/kg, led to a maximum decrease of these parameters. The composition of fatty acids remained unchanged after PEF treatment. In both PEF treated and untreated samples, the predominant fatty acids were C16, C18 and C18:1 as well as small amounts of C16:1, C18:2, C18:3, C22 and C24. As far as extraction processes are concerned it was shown, that PEF treatment can be used for the extraction of hydrophilic substances e.g proteins (22.1 % of total protein at 10 kV/cm, 10 kJ/kg) and DNA (70.9 % of total DNA at 5 kV/cm, 10 kJ/kg). Moreover, it was demonstrated that PEF treatment can be used for the mechanical de-watering of cells. The dry weight was increased from 21.7 % in untreated samples to 26.6 % at 5 kV/cm and 15 kJ/kg. The extraction of lipophilic substance using the gentle extraction solvent Miglyol(R) 812 after PEF treatment did not allow significant lipid extraction yields. In these experiments both batch and continuous treatment strategies, varying electric field strength (0-25 kV/cm) and different energy inputs (0-30 kJ/kg) were applied. However, the application of ultra sound treatment instead of PEF led to extraction yields of 29.2 % of total lipids at 25 kJ/kg. By applying PEF treatment and subsequent gentle heat drying at 60°C it was possible to enhance mechanical de-watering and the drying process. No negative influence of the increased temperature on the fatty acid pattern was seen. Two different options for the integration of PEF treatment into fermentation concepts were tested. As soon as the desired treatment conditions allow high vitalities of the microorganisms after treatment a continuous concept is applicable. It was shown that the cells do not adapt to repeated PEF treatment. In this case the amount of viable cells did not decrease below 63 % after treatment at 1.5 kV/cm and 2.8 kJ/kg every 24 h over a period of 4 days. As soon as the treatment conditions do not allow high vitalities after treatment a semi-contiuous fed-batch approach was tested. The removal of cell suspension from the fermenter and subsequent refilling with fresh media still allowed high cell vitalities above 88 %