Untersuchung der Chromophorstruktur in pflanzlichen und bakteriellen Phytochromen durch Vergleich von gemessenen und berechneten Raman-Spektren

Phytochrome sind Photorezeptorproteine in Pflanzen, Bakterien und Pilzen, die eine Vielzahl von biologischen Prozessen regulieren, wie z.B. Blühverhalten und die Synthese von Pigmenten. Der Photozyklus von Phytochromen zeichnet sich durch zwei quasi-stabile Zustände aus (Pr und Pfr), zwischen denen durch Belichtung mit hell- beziehungsweise dunkelrotem Licht reversibel hin- und hergeschaltet werden kann. Als Kofaktor ist in Phytochromen ein offenkettiges Tetrapyrrol gebunden. Die Photoisomerisierung dieses Chromophors löst über mehrere Zwischenschritte schließlich Konformationsänderungen des Proteins aus. Sowohl die molekularen Mechanismen des Photozyklus als auch die folgende Signalweiterleitung sind in weiten Teilen noch unverstanden. Die Resonanz-Raman- (RR-) Spektroskopie erlaubt es, subtile strukturelle Veränderungen des Chromophors zu beobachten, wobei die Raman-Banden der Proteinumgebung durch (Prä-)Resonanzverstärkung der Chromophorbanden unterdrückt werden. Die strukturellen änderungen des Chromophors während des Photozyklus führen zu gänzlich unterschiedlichen RR-Spektren der verschiedenen Zustände von Phytochromen. Sowohl der Einbau von isotopenmarkierten Chromophoren als auch der Austausch einzelner Aminosäuren in der Umgebung des Chromophors beeinflusst die RR-Spektren in charakteristischer Weise, was Rückschlüsse auf die Chromophorstruktur zulässt. Zur Unterstützung der Analyse der experimentellen Daten wurden Raman-Spektren von Modellsystemen des gebundenen Chromophors berechnet, die die Zuordnung der Banden in den experimentellen Spektren erleichtern. Die Berechnungen wurden mit Methoden der Dichte-Funktional-Theorie unter Verwendung von übertragbaren Skalierungsfaktoren für die Kraftkonstanten für eine große Zahl unterschiedlicher Tetrapyrrolgeometrien durchgeführt. Vor allem im Vergleich mit experimentellen Spektren von Phytochromaddukten mit isotopenmarkierten Chromophoren erlauben diese berechneten Spektren die eindeutige Zuordnung individueller Raman-Banden. Die RR-Spektren von Phytochromen aus unterschiedlichen Organismen zeigen sehr ähnliche charakteristische Bandenmuster in den jeweiligen Zuständen des Photozyklus (d.h. Pr, Meta, Pfr). Insbesondere ist der Chromophor der Zustände Pr und Pfr in allen nativen Phytochromen vollständig protoniert, allerdings wird während der Pr -> Pfr Phototransformation entweder Ring B oder C zeitweilig deprotoniert. Erstaunlicherweise zeigen die RR-Spektren der Pr-Zustände der meisten mutierten Phytochromvarianten kaum Unterschiede zu den Wildtypspektren, obwohl der Großteil der ausgetauschten Aminosäuren in der unmittelbaren Umgebung des Chromophors liegt. Bei Belichtung sind die meisten der untersuchten Phytochrom-Mutanten allerdings nicht in der Lage, den Photozyklus bis zum Pfr-Zustand zu durchlaufen. Zwar zeigen die RR-Spektren, dass die primären Schritte des Photozyklus bis hin zum Zustand Meta-Rc in all diesen Proteinen immer noch möglich sind, aber der letzte Schritt (Meta-Rc -> Pfr) ist in den meisten der getesteten Mutationen blockiert, vermutlich weil die Wiederaufnahme des im vorherigen Schritt abgegebenen Protons gestört ist. Die RR-Spektren der Zustände Pr und Pfr von verschiedenen Phytochromen deuten darüberhinaus auf eine konformationelle Heterogenität aus zwei (oder mehr) Chromophorgeometrien hin, die sich hinsichtlich der Torsionswinkel der AB- und CD-Methinbrücken unterscheiden. Die Heterogenität der Meta-Intermediate ist aufgrund unterschiedlicher Protonierungszustände zusätzlich erhöht. Da der Chromophor in seiner inaktiven und aktiven Form (Pr und Pfr) jeweils in mehr als einer Konformation vorliegt, kann die Auslösung der funktionell relevanten Proteinstrukturänderung beim übergang zum Pfr-Zustand nicht mit einer spezifischen Chromophorstruktur verknüpft sein. Stattdessen weisen die Experimente darauf hin, dass diese Strukturänderungen durch die transiente Deprotonierung des Chromophors ausgelöst werden. Basierend auf den Untersuchungen in dieser Arbeit kann damit ein präziseres Modell für den Mechanismus des Photozyklus vorgeschlagen werden, nach dem der Chromophor in Phytochromen nicht als Photoschalter sondern als Phototrigger die Konformationsänderungen des Proteins initiiert.Phytochromes are photosensory proteins that regulate various biological processes in plants, bacteria, and fungi, such as, e.g., flowering or the synthesis of pigments. These functions are linked to the photoactivation of phytochrome which is based on the reversible interconversion between two semi-stable states (Pr and Pfr) by absorption of red or far-red light. The chromophore of phytochrome is a linear tetrapyrrole which undergoes a photoisomerization and subsequent relaxation processes that are eventually coupled to large-scale conformational changes of the protein. Neither the molecular details of the photocycle nor the downstream signal transduction processes are currently well understood. Resonance Raman (RR) spectroscopy allows observing subtle changes of the chromophore structure due to the (pre-)resonance enhancement of the Raman bands of the chromophore over the bands of the protein matrix. The structural changes of the chromophore during the photocycle result in different RR spectra of the various states of phytochromes. The RR spectra of phytochromes with isotopically labeled chromophores or with substitutions of specific amino acids near the chromophore show characteristic effects which allow drawing conclusions regarding the chromophore structure. To complement the experimental data, Raman spectra of model compounds resembling the protein-bound chromophore were calculated in order to obtain an assignment of the bands in the experimental spectra. These calculations, which are based on quantum mechanical force fields obtained by density functional theory and corrected by transferable scaling factors, were carried out for a large number of tetrapyrrole geometries. Especially in comparison with experimental spectra of phytochrome adducts with isotopically labeled chromophores, these calculated Raman spectra allow for the unambiguous assignment of individual vibrational bands. The RR spectra of phytochromes from plants and different other organisms show very similar characteristic band patterns in the respective states of the photocycle (i.e., Pr, Meta, Pfr). The chromophore in the Pr and Pfr states is largely protonated in all native phytochromes, but during the Pr -> Pfr transition, the chromophore is transiently deprotonated at ring B or C. Interestingly, the RR spectra of the Pr states of most mutated phytochromes show hardly any differences compared with the spectra of the wild-type proteins, even though the majority of the substituted residues are in the immediate vicinity of the chromophore. Upon illumination, however, most of these mutant phytochromes are unable to complete the photocycle to the Pfr state. The RR spectra show that the initial steps of the photocycle are still possible in all investigated proteins, but the final step (Meta-Rc -> Pfr) is prohibited in most cases, probably because the transient proton transfer is impaired. The RR spectra of the Pr and Pfr states of several phytochromes suggest a conformational heterogeneity of two (or more) chromophore conformations that differ with respect to the dihedral angles of the AB and CD methine bridges, while the Meta states show an even larger heterogeneity due to the additional presence of different protonation states. Since more than one chromophore conformation exists in both the active and inactive form (Pr and Pfr), the induction of the physiologically relevant changes of the protein structure in the Pr -> Pfr transition cannot be linked to a specific chromophore geometry. Instead, the experiments indicate that the transient deprotonation of the chromophore initiates the structural changes of the protein. Based on the results in this work, a detailed model for the mechanism of the photocycle of phytochromes is suggested, where the chromophore induces the conformational changes of the protein rather as a photo-trigger than as a photo-switch