Microcarrier-based expansion of primary cells for tissue engineering in the bioreactor

Die vorgestellte Arbeit liefert neue Erkenntnisse zur mikroträgerbasierten Expansion von primären mesenchymalen Stammzellen (MSC) und Chondrozyten im Spinnerflaschen-Bioreaktor. Diese Expansionsmethode stellt eine viel versprechende Alternative zur herkömmlichen 2-dimensionalen Monolayerkultur von Primärzellen im Rahmen des Tissue Engineering dar. Zusätzliche Vorteile verspricht die Verwendung von bioresorbierbaren Mikroträgern, welche zusammen mit den expandierten Zellen in die Transplantatherstellung eingehen können. Hierzu war es notwendig, Mikroträger aus PLGA selbst herzustellen und entsprechend ihrer Form und Oberflächenbeschaffenheit, Größe und Größenverteilung, sowie anhand ihres Degradationsverhaltens zu charakterisieren. Zur Etablierung der Methode wurden auch kommerzielle Cytodex Mikroträger verwendet. Neben der erstmaligen Isolierung von MSC mittels Mikroträgern sollte die Adhärenz und Proliferation der Zellen auf den Trägern gezeigt werden. Anschließend wurde das Differenzierungspotential der 3-dimensional expandierten Zellen in osteogene und chondrogene Richtung überprüft. Die PLGA Mikroträger konnten erfolgreich als Kugeln mit glatter Oberfläche in der gewünschten Größe von 100-200µm hergestellt werden. Das Degradationsverhalten entsprach insbesondere beim PLGA 0500 Material, welches aus einem 85:15 Verhältnis an PLA zu PGA besteht, den gewünschten Kriterien. Eine sehr gute Adhärenz der Zellen konnte bereits nach 3h auf allen Mikroträgern nachgewiesen werden, wobei Cytodex 1 die höchsten Werte erreichte. Die direkte Isolierung der in der Zellzahl limitierten MSC mit Hilfe von Mikroträgern konnte erstmals gezeigt werden. Die Zellspezies hatte wenig Einfluss auf die Adhärenz, während eine Adaption an Monolayerbedingungen eine Steigerung der adhärenten Zellen bewirkte. Eine Proliferation war für alle untersuchten Zelltypen nachweisbar, blieb jedoch hinter der Monolayerkultur zurück. Eine Optimierung der mikroträgerbasierten Methode könnte die Wachstumsraten entsprechend verbessern. Das Expansionspotential der mikroträgerbasierten Kultur war durch die gezeigte Rekolonisation frischer Carrier ohne Limitierung und stellt somit einen entscheidenden Vorteil dieser Methode dar. Das Differenzierungspotential der Zellen blieb während der 3D-Expansion erhalten. Die grundsätzliche Verwendbarkeit von resorbierbaren PLGA Mikroträgern konnte gezeigt werden. Insgesamt ist die mikroträgerbasierte Expansion von Zellen im Spinnerflaschen-Bioreaktor eine Erfolg versprechende Methode zur in vitro Vermehrung von primären Zellen.This work provides new insights into the microcarrier-based expansion of primary mesenchymal stem cells (MSC) and chondrocytes in a spinner flask bioreactor. This expansion method displays a promising alternative to the conventional 2-dimensional monolayer culture in the context of tissue engineering. The application of bioresorbable microcarriers, which, combined with the expanded cells, can be used for transplantation, promises additional advantages. For this reason, it was necessary to produce microcarriers from a PLGA polymer and to characterise them in terms of shape and surface structure, size and size distribution, and degradation behaviour. For implementation of the new expansion method, commercially available cytodex microcarriers were used. Next to the isolation of MSC with carriers, the adhesion and proliferation of the cells on the microcarriers was shown. Subsequently, the differentiation potential of the 3-dimensionally expanded cells was evaluated for the osteogenic and chondrogenic lineage. The PLGA microcarriers could be produced successfully as spheres with a plane surface structure in the desired size of 100-200µm diameter. The degradation behaviour was satisfying especially for the PLGA 0500 material, which consists of 85% PLA. Very good adhesion of the cells to the carriers was distinguished after 3h of incubation whereas cytodex type 1 showed the highest number of adherent cells. Additionally, the isolation of MSC via microcarriers from bone marrow could be demonstrated. Porcine and human cell types behaved the same on behalf of adhesion, whereas an additional passage caused an increase of adherent cells. Proliferation was detectable for all cell types but revealed higher generation times compared to the monolayer culture. An optimisation of the microcarrier-based method could improve the expansion rate. One advantage of this method is the unlimited expansion potential due to recolonisation of freshly added microcarriers, which could be presented clearly. The differentiation potential of the cells was maintained during the 3-dimensional expansion. The usability of biodegradable PLGA microcarriers for these purposes could be shown. Totalling the results, the microcarrier-based expansion in spinner flasks is a promising method for the in vitro progeny of primary cells