94 GHz Elektronenspinresonanz : methodische Entwicklungen und Untersuchungen an Reaktionszentren der Photosynthese

Diese Arbeit befaßt sich mir der Anwendung von Elektronenspinresonanz (EPR) bei 94 GHz zur Untersuchung von radikalischen Zuständen in Reaktionszentren des pflanzlichen und bakteriellen Photosyntheseapparates. Die Lichtanregung in situ bereitet bei der Hochfrequenz-EPR Schwierigkeiten, da ein optischer Zugang zum Resonator mit deutlichen technischen Kompromissen erkauft werden muß. In dieser Arbeit wird deshalb zunächst eine Methode zur Lichtanregung in geschlossenen Resonatorstrukturen vorgestellt und charakterisiert. Ein weiteres Problem liegt in der hohen Empfindlichkeit der Hochfrequenz-EPR auf Untergrundsignale, die von Verunreinigungen der Proben ausgehen. Unterscheiden sich die Übergangsdipolmatrixelemente von Probe und Kontamination, können die Signale mit gepulster EPR getrennt werden. Eine neue Methode hierzu wird in dieser Arbeit vorgestellt. Im Gegensatz zu den üblichen Verfahren erfordert das neu eingeführte Experiment deutlich weniger Meßzeit und kleinere Mikrowellenleistungen. Die Leistungsfähigkeit von 94 GHz-EPR zur Untersuchung von Reaktionszentren der Photosynthese wird an drei Beispielen demonstriert: Das Kationenradikal des primären Donators in Photosystem (PS) I, P700+, weist eine geringe g-Anisotropie und eine hohe EPR-Linienbreite auf. Um aussagekräftige Spektren zu erhalten, waren bislang äußerst hohe Frequenzen erforderlich. Die Verwendung von Protein-Einkristallen in dieser Arbeit erlaubte die genaue Bestimmung des g-Tensors aus den 94 GHz-Spektren. Durch den Vergleich mit der aus der Rötgenstrukturanalyse bekannten Orientierung der entsprechenden Chlorophyllmoleküle konnte die in früheren Arbeiten vorhergesagte asymmetrische Verteilung der Spindichte bestätigt werden. Die Kristallisation von Photosystem II ist erst seit kurzem möglich. Die in den wahrscheinlich weltweit ersten EPR-Experimenten an PS II-Einkristallen erhaltenen orientierungsabhängigen Spektren des stabilen Tyrosinradikals YD sind, bedingt durch eine Vielzahl von Hyperfeinkopplungen und 8 kristallographisch inäquivalenten Einbaupositionen, äußerst kompliziert. In Verbindung mit gepulsten ENDOR-Experimenten an gefrorener Lösung gelang die vollständige Analyse der Spektren. Die mit hoher Genauigkeit erhaltene Orientierung des g-Tensors ergänzt das nislang noch in weiten Teilen unvollständige Strukturmodell von PS II. Aus den gefundenen g-Hauptwerten und den Hyperfeinkopplungen lassen sich Rückschlüsse auf die Bindungssituation des Tyrosinradikals ziehen. Insbesondere konnte der Einfluß einer Wasserstoffbrücke im Detail erfaßt werden. Untersuchungen an den radikalischen Zuständen der Akzeptormoleküle QA und QB im Reaktionszentrum des Purpurbakteriums Rhodobacter sphaeroides beschließen die Arbeit. Aus den Spektren im biradikalischen Zustand QA-QB konnte - über die Richtungsabhängigkeit der dipolaren Kopplung - die relative Anordnung der Radikale im Protein ermittelt werden. Diese unterscheidet sich im Rahmen der Meßgenauigkeit nicht von der bekannten Struktur im monoradikalischen Zustand QB-. Die für den Elektronentransfer bedeutsame Stärke der Austauschkopplung zwischen den Radikalen konnte hingegen nur näherungsweise bestimmt werden. Es wird gezeigt, daß sich hier eine Grenze der EPR bei 94 GHz offenbart, die nur durch Verwendung noch höherer Mikrowellenfrequenzen überwunden werden kann