Characterization of morphological and physico-chemical properties of microorganisms and components of cell by atomic force microscopy

Cílem bakalářské práce byla charakterizace bakteriálních buněk Rhodospirillum rubrum, které produkují polyhydroxyalkanotáty (PHA) a Rhodospirillum rubrum phaC bez schopnosti produkce intracelulárních granulí PHA pomocí mikroskopie atomárních sil. Dále byly touto metodou také charakterizovány izolované polyhydroxyalkanoátových granulí v jejich nativním stavu. Při přípravě vzorků, konkrétně pro fixaci bakteriálních buněk i izolovaných PHA granulí byl využit Poly-L-lysin, který byl aplikován na oplazmovaná podložní sklíčka při koncentraci 0,01 mg/ml. Testovaným hrotem byl hrot MLCT – A. První získanou charakteristikou byly topografické snímky buněk Rhodospirillum rubrum a Rhodospirillum rubrum phaC a izolovaných PHA granulí. Bakteriální buňky a PHA granule byly dále charakterizovány pomocí Youngova modulu. Pro jeho získání byla navrhnuta metoda, při které byly nejprve snímány celé buňky, respektive PHA granule, a následně bylo v případě buněk provedeno měření zaměřené na jednotlivá místa na buňce. Naměřená data byla nejprve vyhodnocena v softwaru JPK Data Processing pomocí Hertzova modelu aproximace dat. Toto vyhodnocení se ukázalo jako nespolehlivé, proto byla navrhnuta druhá metoda, při které se k vyhodnocení použily směrnice přímek získaných se strmých částí křivky „extend“. Jako spolehlivější měření bylo zvoleno měření celých buněk, protože u něj vycházely menší odchylky a byly získány informace o celém povrchu buňky či granule. Směrnice Rhodospirillum rubrum dosahovala hodnoty (4,5±1,5) nN/µm a pro Rhodospirillum rubrum phaC (14,1±4,4) nN/µm. Z toho byl potvrzen předpoklad, že buňky Rhodospirillum rubrum obsahující PHA granule vykazují rozdílnou tuhost oproti buňkám Rhodospirillum rubrum phaC bez přítomnosti PHA granulí. Směrnice pro izolované PHA granule byla stanovena (9,0±1,0) nN/µm. Při jejím porovnání se směrnicemi bakteriálních buněk vyplývá, že PHA granule vykazují tuhost, která se nachází v rozmezí mezi tuhostí Rhodospirillum rubrum a Rhodospirillum rubrum phaC.The aim of this bachelor thesis was to characterize Rhodospirillum rubrum bacterial cells that produce polyhydroxyalkanotate (PHA) and Rhodospirillum rubrum phaC without the ability to produce intracellular PHA granules using atomic force microscopy. Furthermore, isolated polyhydroxyalkanoate granules in their native state were also characterized by this method. Poly-L-lysine was used in the preparation of the samples, specifically for fixation of bacterial cells and isolated PHA granules, and was applied to slides that had been exposed to plasma at a concentration of 0.01 mg/ml. The tip tested was the MLCT - A tip. The first characteristics obtained were topographic images of Rhodospirillum rubrum and Rhodospirillum rubrum phaC cells and isolated PHA granules. The bacterial cells and PHA granules were further characterized using Young's modulus. To obtain it, a method was designed in which whole cells and PHA granules were first imaged, respectively, and then, in the case of cells, measurements were made targeting individual locations on the cell. The measured data were first evaluated in JPK Data Processing software using the Hertzian data approximation model. This evaluation proved to be unreliable, so a second method was devised using the directive lines obtained with the steep parts of the "extend" curve to evaluate. Whole-cell measurement was chosen as a more reliable measurement because it yielded smaller deviations and provided information about the entire surface of the cell or granule. The Rhodospirillum rubrum directive was (4.5±1.5) nN/µm and for Rhodospirillum rubrum phaC was (14.1±4.4) nN/µm. This confirmed the hypothesis that Rhodospirillum rubrum cells containing PHA granules exhibit different stiffness compared to Rhodospirillum rubrum phaC cells without the presence of PHA granules. The directive for isolated PHA granules was determined to be (9.0±1.0) nN/µm. When compared with the directives of bacterial cells, it shows that the PHA granules exhibit a stiffness that lies between that of Rhodospirillum rubrum and Rhodospirillum rubrum phaC.