Fluorescence spectroscopy in research on the organization of biological membranes

Bakalářská práce se zabývá srovnáním a optimalizací metod studia biologických membrán pomocí fluorescenční spektroskopie a mikroskopie s využitím bakterie Cupriavidus necator H16 (obsahující PHB granule) a PHB-4 (neobsahující PHB granule) jako modelového organismu. Experimentálně byla určena vhodná koncentrace sondy laurdan pro barvení biologických membrán a čas potřebný k jejímu průniku do buňky. Takto obarvené organismy byly dále studovány pomocí steady-state spektrofluorimetrie, při které byl zkoumán vliv teploty na tvar emisního spektra a také možnost promývání jako jednoho z kroků při přípravě vzorků. Obě tato měření naznačují výhodnost promývání, ale neposkytují nezpochybnitelné výsledky. Rozdíl mezi dvěma kmeny bakterie byl ale pozorován. Dále byly bakterie podrobeny fluorescenční mikroskopii. Tato metoda se projevila jako potenciálně užitečná pro studium výraznějších variací ve stupni uspořádání membrán buněčné membrány a pro zobrazování dalších větších útvarů. Distribuce laurdanu v rámci Cupriavidu necator H16 působí nerovnoměrněji ve srovnání s PHB-4. Získané poznatky tak naznačují vliv přítomnosti granulí při barvení fluorescenčními sondami, nelze je ale interpretovat jednoznačně.This bachelor's thesis deals with the comparison and optimization of methods for studying biological membranes using fluorescence spectroscopy and microscopy, utilizing the bacteria Cupriavidus necator H16 (containing PHB granules) and PHB-4 (not containing PHB granules) as model organisms. The appropriate concentration of the membrane probe laurdan for staining biological membranes and the time required for its penetration into the cell were determined. Organisms stained in this way were further studied using steady-state spectroscopy, which helped examine the influence of temperature on the shape of the emission spectrum and the possibility of washing as one of the steps in sample preparation. Both of these measurements suggest the advantages of washing but do not provide definite results. However, a clear difference between the two bacterial strains was observed. Furthermore, the bacteria were studied by fluorescence microscopy. This method proved to be potentially useful for studying significant variations in the membrane order of the cell membrane and for imaging other larger structures. The distribution of laurdan within Cupriavidus necator H16 appears more uneven compared to PHB-4. The findings thus suggest the influence of granule presence when staining with fluorescent probes, but they cannot be interpreted definitively.