Use of optical and microfluidic techniques for analysis and separation of microbial cells

Predkladaná diplomová práca sa zaoberá predovšetkým Ramanovou spektroskopiou a jej prepojeniami s mikrofluidnými technikami spolu s potenciálne biotechnologicky zaujímavými produktmi bakteriálnych kmeňov Janthinobacterium lividum a Azotobacter vinelandii. Metódy použité v tejto práci boli zvolené pre ich nedeštruktívnu povahu, ktorá umožňuje rýchlu analýzu buniek a ich porovnanie s plynovou chromatografiou. Po analýze je možné bunky ďalej kultivovať, prípadne pripraviť generáciu s nadmernou produkciou vybraného metabolitu. Janthinobacterium lividum je bakteriálny kmeň produkujúci pigment - violaceín, ktorý má značný biotechnologický potenciál ako liečivo, antioxidant, fluorescenčná sonda či farbivo. Schopnosť rozlíšiť bunky produkujúce a neprodukujúce violaceín môže mať preto široké uplatnenie v diagnostike a identifikácii. V experimentálnej časti boli zmerané spektrá troch kmeňov, na základe ktorých bol vybraný zástupca Janthinobacterium lividum CCM 160, ktorý bol analyzovaný využitím Ramanovskej pinzety spolu s Cupriavidus necator H16. Vyhodnotením pomocou analýzy hlavných komponentov bola zistená rozlíšiteľnosť pigmentovaných kultúr od nepigmentovaných a bol vybraný potenciálny triediaci marker 1 140 cm-1 (príslušný pre violaceín) pre ďalšie merania. Biotechnologický potenciál kmeňa Azotobacter vinelandii spočíva v schopnosti fixovať dusík z atmosféry, produkovať alginát a polyhydroxybutyrát. Experimentálna časť práce sa zameriava na identifikáciu Ramanových spektier piatich kmeňov a alginátov extrahovaných z nich. Polyhydroxybutyrát (PHB) je biologicky odbúrateľný polymér nahrádzajúci petrochemické plasty. Pre výrobu PHB je Azotobacter vinelandii adeptom pre komerčnú výrobu, ktorý ako jeden z mála vyrába PHB priamo zo vzdušného dusíka, čo môže viesť k zníženiu výrobnej ceny a tým aj vyššiemu zastúpenia rozložiteľných plastov na trhu. Najvyššia odpoveď pre PHB v Ramanových spektrách bola nameraná u Azotobacter vinelandii DSM 720 a naopak najnižšia u Azotobacter vinelandii DSM 85. Kvantitatívne informácie pre porovnanie boli získané z plynovej chromatografie, ktoré potvrdili merania z Ramanovej spektroskopie. Vyhodnotením nameraných Ramanových spektier čistých alginátov je možné predpokladať, že sa jedná o heteropolymérne frakcie, keďže v spektrách bol detegovaný prejav rôznych monomérov. V závislosti od zloženia podjednotiek sa menia vlastnosti alginátu, preto je potrebné poznať zloženie pre jeho úpravu pre ďalšie využitie v medicíne alebo potravinárstve. Z piatich kmeňov Azotobacter vinelandii boli vybraní producenti s najvyšším a najnižším obsahom PHB, ktorí boli následne analyzovaní pomocou Ramanovej pinzety. Vyhodnotením pomocou analýzy hlavných komponentov bola zistená rozlíšiteľnosť týchto kmeňov a možnosť ich následného oddelenia využitím triediaceho parametra (1 060 cm-1).The presented diploma thesis primarily focuses on Raman spectroscopy and its connections to microfluidic techniques, along with potentially biotechnologically interesting products of bacterial strains Janthinobacterium lividum and Azotobacter vinelandii. The methods were chosen for their non-destructive nature, which allows for rapid cell analysis and comparison with gas chromatography. After analysis, cells can be further cultivated or a generation with excessive production of a selected metabolite can be prepared. Janthinobacterium lividum is a bacterial strain that produces the pigment violacein, which has significant biotechnological potential as a drug, antioxidant, fluorescent probe, or dye. The ability to distinguish between cells producing and not producing violacein can have wide applications in diagnosis and identification. In the experimental part, the spectra of three strains were measured, based on which Janthinobacterium lividum CCM 160 was selected for analysis using Raman tweezers, along with Cupriavidus necator H16. By evaluating with principal component analysis, the distinguishability of pigmented cultures from non-pigmented ones was determined, and a potential sorting marker of 1 140 cm-1 (corresponding to violacein) was selected for further measurements. The biotechnological potential of the Azotobacter vinelandii strain lies in its ability to fix nitrogen from the atmosphere, produce alginate, and polyhydroxybutyrate. The experimental part of the thesis focuses on identifying Raman spectra of five strains and the extracted alginates from them. Polyhydroxybutyrate (PHB) is a biodegradable polymer that replaces petrochemical plastics. For PHB production, Azotobacter vinelandii is an adept for commercial production, as it is one of the few that produces PHB directly from atmospheric nitrogen, which can lead to reduced production costs and thus higher representation of degradable plastics in the market. The highest response for PHB in Raman spectra was measured for Azotobacter vinelandii DSM 720 and the lowest for Azotobacter vinelandii DSM 85. Quantitative information for comparison was obtained from gas chromatography, which confirmed the measurements from Raman spectroscopy. By evaluating the measured Raman spectra of pure alginates, it is possible to assume that they are heteropolymeric fractions, as the spectra showed the expression of various monomers. Depending on the composition of subunits, the properties of alginate change, so it is necessary to know the composition for its adjustment for further use in medicine or the food industry. From the five Azotobacter vinelandii strains, producers with the highest and lowest PHB content were selected, which were subsequently analysed using Raman tweezers. By evaluating with principal component analysis, the distinguishability of these strains and their separability using the sorting parameter of 1 060 cm-1 was determined.