MESSA A PUNTO DI UN METODO PER LA VALUTAZIONE DELL’ATTIVITÀ MULTI-FUNZIONALE DELL’ENZIMA AKR1B1

L’aldoso reduttasi (AKR1B1) è un enzima NADPH-dipendente in grado di ridurre un’ampia varietà di aldeidi, sia idrofiliche che idrofobiche. L’AKR1B1 gioca un ruolo chiave nella prima tappa della via dei polioli in cui l’enzima riduce il D-glucosio in sorbitolo, il quale viene convertito in fruttosio mediante l’attività della sorbitolo deidrogenasi, enzima NAD+-dipendente. In condizioni iperglicemiche un elevato flusso di glucosio incrementa l’attività catalitica di questi enzimi con il conseguente sviluppo di molti danni cellulari. L’aumento della concentrazione di sorbitolo nella cellula provoca un incremento dell’osmolarità cellulare con conseguente danno osmotico. Il fruttosio, prodotto massivamente durante queste condizioni, si comporta da agente glicante delle proteine, per cui si nota un aumento di prodotti di glicazione avanzata (AGEs) che portano in ultimo a stress infiammatorio. Inoltre, la via dei polioli è un pathway che consuma NADPH, cofattore essenziale per l’attività della glutatione reduttasi con conseguente aumento dello stress ossidativo. Questi processi scatenano una sofferenza cellulare generalizzata che può portare all’insorgenza di complicazioni diabetiche gravi come le nefropatie, retinopatie e cataratta. All’azione dannosa dell’aldoso reduttasi che si realizza in queste condizioni, però, si contrappone un suo ruolo detossificante. L’enzima, infatti, è in grado di ridurre alcune aldeidi ad azione tossica per la cellula come il 4-idrossi-2,3-nonenale (HNE) che viene prodotto durante il processo della perossidazione lipidica; l’HNE è substrato dell’enzima AKR1B1 e viene convertito nel suo corrispondente alcol, il 1,4-diidrossinonene (DHN), composto meno reattivo e sostanzialmente privo di tossicità. Si pone quindi il problema di ricercare inibitori differenziali (ARDIs) in grado di intervenire selettivamente sull’attività catalitica dell’enzima, inibendone l’attività solo su specifici substrati, come il glucosio, senza intaccarne l’azione su altre molecole, come l’HNE. Questo significherebbe lasciare inalterata l’azione detossificante dell’aldoso reduttasi evitando danni citotossici e bloccare invece il ruolo dannoso che si verifica nelle condizioni iperglicemiche. L’obiettivo di questo lavoro di tesi riguarda la pianificazione e la messa a punto di una metodica sperimentale mediante la quale diviene possibile valutare la potenziale azione inibente differenziale di molecole di interesse sull’attività multi-funzionale dell’enzima AKR1B1. Nel tentativo di avvicinarsi il più possibile alle condizioni cellulari, utilizzando un saggio enzimatico in vitro, la metodica prevede la valutazione dell’attività enzimatica AKR1B1 ricombinante umana in presenza di due substrati presenti contemporaneamente nella miscela di saggio, in modo da poter discriminare l’attività dell’enzima in presenza di un substrato ovvero L-idoso, il 5-C epimero del D-glucosio che simula il substrato fisiologico, dall’attività sul substrato HNE e valutare come tale duplice attività possa essere alterata in presenza di un potenziale inibitore differenziale. Aldose reductase (AKR1B1) is a NADPH-dependent enzyme capable of reducing both hydrophilic and hydrophobic aldehydes. AKR1B1 plays an important role in the first step of the polyol pathway in which the enzyme reduces D-glucose to sorbitol, which is converted to fructose by sorbitol dehydrogenase, a NAD+-dependent enzyme. In hyperglycaemic conditions, a high flow of glucose increases the catalytic activity of these enzymes with the consequent development of many cellular damages. The increase of sorbitol in the cell intensifies the cellular osmolarity with consequent osmotic damage. Fructose, massively produced during these conditions, leads to an increase in the production of advanced glycation products (AGEs) which causes inflammatory stress. The polyol pathway consumes NADPH, an essential cofactor for the activity of glutathione reductase, causing an increase in oxidative stress. These events trigger a generalized cellular suffering that can lead to serious diabetic complications such as nephropathies, retinopathy and cataract. In addition, aldose reductase, also act as a detoxifying enzyme. In fact, AKR1B1 can reduce some toxic aldehydes such as 4-hydroxy-2,3-nonenal (HNE), produced during the lipid peroxidation process, into 1,4-dihydroxynonene (DHN), a less reactive and substantially non-toxic compound. Recent studies regarding the search of differential inhibitors (ARDIs), compounds capable of inhibiting AKR1B1 only on specific substrates, such as glucose, without affecting the capacity of the enzyme to react with other molecules, such as HNE. An ARDI would leave unaltered the detoxifying action of aldose reductase, avoiding cytotoxic events, and would block its damaging role that occurs in hyperglycaemic conditions. The purpose of this thesis project focuses on the planning and development of an experimental method used to evaluate the potential differential inhibitory action of molecules of interest on the multi-functional activity of AKR1B1 enzyme. In order to imitate the cellular conditions, an in vitro enzymatic assay used to evaluate the activity of AKR1B1 in the presence of two substrates added simultaneously, has been developed. This method could be useful to discriminate the enzymatic activity of AKR1B1 on L-idose from HNE evaluating also how the presence of a potential ARDI can modify the enzymatic activity on both substrates