Electrochemical Detection of Enzyme Activity of Kinases Immobilized on Magnetic Particles

Proteinkinázy jsou enzymy zajišťující jednu z nejdůležitějších posttranslačních modifikací proteinů, fosforylaci. Fosforylace reguluje nejen fyziologické buněčné procesy, ale je také zapojena do takových patologických reakcí spojených s mnoha nemocemi. Proto je důležité sledovat aktivitu kinázy a inhibitorů, na což je kladen důraz při vývoji terapeutických cílů. Proteinkináza A byla imobilizována kovalentně na magnetických částicích. Pro stanovení enzymové aktivity byl nízkomolekulární substrát Kemtide fosforylován v přítomnosti adenosin-thiotrifosfátu (ATP-S). Thiofosforylovaný peptid následně spontánně reagoval s nanočásticemi koloidního zlata (AuNP) a následovala čtvercová katodická stripovací voltametrická analýza na sítotiskových uhlíkových elektrodách. Generovaný signál [AuCl4]- odpovídá úrovni fosforylace a tím i aktivitě enzymu.Protein kinases are enzymes providing one of the most important protein post-translational modifications, phosphorylation. Phosphorylation regulates not only physiological cell processes but also is involved in such pathological reactions associated with many diseases. Therefore, it is important to monitor the activity of kinase and inhibitors which is highlighted in the development of therapeutic targets. Protein kinase A was immobilized covalently on magnetic particles. For determination of enzyme activity, low-molecular-mass substrate Kemtide has been phosphorylated in presence of adenosine-thio triphosphate (ATP-S). Thiophosphorylated peptide subsequently spontaneously reacted with colloidal gold nanoparticles (AuNPs) followed by square-wave cathodic stripping voltammetric analysis on screen-printed carbon electrodes. Generated signal of [AuCl4]- corresponds to the level of phosphorylation and thus the activity of the enzyme