Detection and Identification of viruses infecting Musa spp. using Polymerase Chain Reaction and High Throughput Sequencing technologies

Le virus de la mosaïque atténuée du bananier (BanMMV) (Betaflexiviridae, Quinivirinae, espèce non attribuée) est un virus filamenteux appartenant à la famille des Betaflexiviridae. Il infecte Musa spp. avec une très large répartition géographique. Il présente un risque important pour la filière bananière notamment dans les différents DROMs, et semble remplir les critères d'un organisme réglementé non de quarantaine. Par conséquent, il est important d'établir des mesures de contrôle appropriées basées sur la mise en place des techniques de diagnostic spécifiques et sensibles. BanMMV présente une variabilité génomique très élevée qui rend sa détection moléculaire par des amorces spécifiques particulièrement difficile, et nécessite le développement de tests diagnostiques à forte inclusivité. La détection et/ou l'assainissement du BanMMV reste laborieux et chronophage. Le processus actuel d'indexage d'une accession vis-à-vis de ce virus nécessite de tester pas moins de quatre plantes cultivées en serre pendant au moins 6 mois, ce qui entraîne un retard important dans la distribution du matériel génétique. L'objectif principal de cette thèse était d'améliorer le diagnostic de BanMMV à partir d'accessions de Musa. Cette étude visait à développer de nouvelles amorces de diagnostic afin d'améliorer la détection de BanMMV, suite à l'identification de nouveaux isolats de ce virus. Cette étude visait également à tester l'utilisation de plants de bananier in vitro afin d'accélérer le processus de test et d'évaluer le succès de la thérapie virale. Dans ce contexte, une divergence dans les résultats des tests a été observée entre la microscopie électronique et les résultats des tests d'immunocapture (IC) de transcription inverse (RT) de réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour une accession de bananier asymptomatique. L'absence de détection moléculaire et la présence de particules filamenteuses suggèrent la présence d'un nouveau variant ou d'un nouveau virus. L'accession a subi un séquençage à haut débit qui a permis l'identification de deux génomes complets de BanMMV avec une identité nucléotidique élevée qui constituent les deux nouveaux isolats de BanMMV trouvés dans cette accession. Ces découvertes ont permis le développement d'une nouvelle amorce de diagnostic basée sur ces deux nouvelles séquences ainsi que les séquences BanMMV CP déjà publiées dans GenBank. Une analyse rétrospective de 110 accessions différentes de matériel génétique d'origines diverses a été réalisée afin de comparer les amorces BanMMV CP9 et BanMMCP2. Cinq accessions ont montré des résultats contrastés. La nouvelle amorce a échoué de détecter le BanMMV à partir de trois accessions. De même, BanMMCP2 n'a pas réussi à détecter l'infection par BanMMV à partir de deux accessions de bananiers. Par contre, la sensibilité analytique était meilleure avec BanMMV CP9 par rapport à BanMMCP2. A travers cette étude, nous avons recommandé l'utilisation des deux amorces successivement pour améliorer l'inclusivité du protocole. Les technologies HTS constituent l'une des avancées les plus importantes qui ont révolutionné le diagnostic moléculaire. Leur adoption dans le diagnostic des ravageurs des plantes, en particulier le diagnostic des virus des plantes, n'a cessé de croître au cours des dernières décennies. Dans ce contexte, cette étude a montré l'amélioration des performances de ces technologies dans la détection de BanMMV par rapport aux techniques moléculaires conventionnelles issues des mêmes plantes (en absence de thérapie). Ces technologies sans a priori étaient beaucoup plus sensibles que la RT-PCR à partir des mêmes plantes in vitro avec 100% de sensibilité diagnostique (DSE) pour le HTS par rapport à une DSE de 65% pour la RT-PCR. Les technologies HTS ont permis l'identification d'une nouvelle espèce à partir de ces échantillons, avec un génome de 7,364 pb, présentant une organisation génomique typique des membres de Betaflexiviridae après annotation de son nouveau contig. Donc, il pourrait être intéressant d'envisager la caractérisation biologique approfondie de cette nouvelle espèce à l'aide de diverses expériences et investigations. Cela aiderait à en savoir plus sur la symptomatologie, la transmission, la gamme d'hôtes de la nouvelle espèce et son impact sur l'industrie bananière et/ou l'environnement. En résumé, cette étude a proposé deux tests pour la détection de BanMMV à partir de plantes in vitro. Les technologies HTS pourraient être réalisées à partir d'extraits d'ARN de feuilles ou de bases regroupées d'au moins quatre plantes par accession. Si ces technologies ne sont pas disponibles ou trop chères, la RT-PCR pourrait être appliquée à la place à partir des ARNs d’au moins 4 plantes de chaque accession. Cette méthodologie proposée permet d'éviter la culture en serre et donc de gagner du temps et de l'espace