Formulation of a carrier system to deliver a CRISPR-Cas-based antiviral

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.Introdução: Nas últimas décadas temos observado a emergência de pandemias causadas por vírus. A rapidez com que um vírus sofre mutações é um fator importante que contribui para a inativação de antivirais e o desenvolvimento de novos medicamentos é um processo moroso, que atualmente não acompanha a evolução dos vírus. Assim, a terapia génica com sistemas CRISPR-Cas pode ser útil, uma vez que após desenvolvimento da primeira terapêutica, apenas é necessário reformular o sgRNA para tornar uma sequência genética diferente o novo alvo da mesma terapêutica. O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento e comparação de três sistemas de transporte que fossem capazes de transportar eficazmente os componentes deste sistema no organismo humano. Métodos: Nanopartículas de albumina sérica bovina (BSA), de uma mistura de polímeros e de um poli(β-amino éster) (PBAE) foram formuladas por nanoprecipitação, e encapsuladas com siRNA ou mRNA. As partículas foram caracterizadas de acordo com o tamanho, índice de polidispersão (PDI), potencial zeta, eficiência de encapsulação e estabilidade em diferentes soluções. Ensaios de citotoxicidade, expressão de eGFP e libertação endossomal foram realizados em células de adenocarcinoma pulmonar (A549). Resultados: Para os três tipos de partículas foi possível obter diâmetros inferiores a 200 nm, sendo as particulas de mRNA geralmente maiores que as de siRNA. O PDI obtido rondou os 0.2, os potenciais zeta foram catiónicos e a encapsulação eficiente (>90%), representando características ótimas para a administração in vivo. As partículas demostraram alguma citotoxicidade e a expressão de eGFP após a transfecção de mRNA foi apenas confirmada para as partículas de PBAE. Apenas uma pequena percentagem destas partículas foram capazes de se libertar dos endossomas. Conclusões: Os três tipos de partículas demonstraram resultados promissores e indicam a possibilidade de, com o desenvolvimento da investigação, poder vir a ser possível aplicar a terapia génica ao tratamento de infeções virais.Introduction: In the last decades, viral infections have led to pandemic situations and the quickness with which a virus mutates is an important factor that contributes to the inactivation of antivirals. The development of new medicines is a lengthy process, which currently cannot accompany the evolution of viruses. Thus, gene therapy with CRISPR-Cas systems might be useful, since once the therapy is developed, there is only the need to reformulate the sgRNA, in order to make another gene sequence the new target of the same therapy. The aim of this study was the development and comparison of three delivery systems, that are able to efficiently transport the system’s components in the human organism. Methods: Bovine serum albumin (BSA), polymer blend and poly(β-amino ester) (PBAE) nanoparticles were formulated through nanoprecipitation and encapsulated with siRNA or mRNA. The particles were characterized according to their size, polydispersity index (PDI), zeta potential, encapsulation efficiency and stability in different solutions. Cytotoxicity, eGFP expression and endosomal escape assays were performed on lung adenocarcinoma cells (A549). Results: For the three types of particles, it was possible to obtain diameters below 200 nm, with mRNA-loaded particles frequently larger than siRNA particles. The PDI was around 0.2, the zeta potentials were cationic, and the encapsulation was efficient (>90%), representing optimal characteristics for in vivo administration. The particles induced low levels of cytotoxicity, and eGFP expression after mRNA transfection was only confirmed for PBAE particles. Only a small percentage of these NPs seemed to have escaped the endosomes. Conclusions: The three types of particles show promising results and indicate the possibility that, with the continuing of the investigation, it may become possible to apply gene therapy for the treatment of viral infections.Department of Pharmacy of the Ludwig-Maximilians-Universität München, Germany