Séquençage de 3ème génération appliqué à une analyse multi-échelles des effets biologiques induits par les rayonnements ionisants et les nanoparticules d'oxyde métallique

DNA/RNA sequencing methods have undergone swift technological progress and are now major analysis tools. Their use allows the study of the cellular impact caused by exposure to environmental factors from the DNA sequence to the expression of genes. This technology is applied in the particular case of the study of radiation and nano-induced damage. However, due to the particular and random nature of the physicochemical interactions of ionizing radiation (IR) and nanoparticles (NPs) with living organisms at different molecular and cellular scales (heterogeneity of energy deposition, heterogeneity of NPs internalization), it remains difficult to define precisely the radio- and nano-induced mechanisms. Thus, the opportunity to combine targeted and controlled micro-irradiation experiments, quantitative chemical micro-analysis and Monte Carlo simulations/modeling (Geant4/Geant4DNA) allows to better characterize the doses delivered at the cellular level in in vitro and in vivo conditions.In this interdisciplinary context, my thesis project consisted in integrating all the tools and methods necessary for the application of a 3rd generation sequencing technology (MinION, Oxford Nanopore Technologies) in order to study the consequences on DNA and RNA of radiation and nano-induced exposures.I thus introduced and validated bioinformatics tools that allowed me: (i) to exploit the potentialities of long-read sequencing on reference DNA molecules in order to quantify radiation-induced fragmentation and to compare these experimental data with Monte Carlo simulation data; (ii) to analyze the transcriptomic responses of Caenorhabditis elegans nematode populations selectively irradiated in controlled dose (gonad progenitor stem cells) or exposed to titanium dioxide nanoparticles; (iii) to evaluate on genetically characterized sarcoma lines, the cellular responses induced in vitro by combined exposures to ionizing radiation and metal oxide nanoparticles; (iv) to approach the study of the transcriptome at the single-cell level ("Single-Cell RNA-Seq") with the objective of future applications to the analysis of radio- and nano-induced responses at the organism's cell level.Les méthodes de séquençage ADN/ARN ont connu des progrès technologiques fulgurants et sont aujourd’hui des outils majeurs d’analyse. Leur utilisation permet ainsi d’étudier l’impact cellulaire causé par l’exposition à des facteurs environnementaux depuis la séquence de l’ADN jusqu’à l’expression des gènes. Cette technologie est appliquée du cas particulier de l’étude des dommages radio- et nano-induits. Cependant, de par la nature particulière et aléatoire des interactions physico-chimiques des rayonnements ionisants (RI) et des nanoparticules(NPs) avec les organismes vivants aux différentes échelles moléculaires et cellulaires (hétérogénéité du dépôt d’énergie, hétérogénéité de l’internalisation des NPs), il reste difficile de définir précisément les mécanismes radio- et nano-induits. Ainsi, l’opportunité de combiner des expériences de micro-irradiation ciblée et contrôlée, de micro-analyse chimique quantitative et des simulations/modélisations Monte Carlo (Geant4/Geant4DNA) permet de mieux caractériser les doses délivrées à l’échelle cellulaire en conditions in vitro et in vivo. Dans ce contexte interdisciplinaire, mon projet de thèse a consisté à intégrer l’ensemble des outils et méthodes nécessaires à l’application d’une technologie de séquençage de 3ème génération (MinION, Oxford Nanopore Technologies) afin d’étudier les conséquences sur l’ADN et sur l’ARN d’expositions radio- et nano-induites.J’ai ainsi introduit et validé les outils bio-informatiques qui m’ont permis : (i) d’exploiter les potentialités du séquençage « long-read » sur des molécules ADN de référence afin de quantifier la fragmentation radio-induite et de confronter ces données expérimentales aux données de simulation Monte Carlo ; (ii) d’analyser les réponses transcriptomiques de populations de nématodes Caenorhabditis elegans sélectivement irradiées en dose contrôlée (cellules souches progénitrices des gonades) ou bien exposées à des nanoparticules de dioxyde de titane ; (iii) d’évaluer sur des lignées de sarcomes génétiquement caractérisées, les réponses cellulaires induites in vitro par des expositions combinées aux rayonnements ionisants et aux nanoparticules d’oxydes métalliques ; (iv) d’aborder l’étude du transcriptome à l’échelle de la cellule unique (« Single-Cell RNA-Seq ») dans l'objectif de futures applications à l’analyse des réponses radio- et nano-induite à l'échelle de la cellule d’un organisme