Viral diarrhoea in swine: contributions to diagnosis and control

241 p.[ES] Las condiciones actuales de la producción porcina demandan un elevado estatus sanitario y de bienestar animal e implican un estricto control de las enfermedades de etiología infecciosa. Entre estas, las enfermedades entéricas siguen teniendo un papel muy relevante, especialmente en las primeras fases de la producción. Sin embargo, en los años más recientes, los procesos entéricos de etiología vírica han visto incrementada su relevancia en las explotaciones porcinas. Así, han emergido y/o reemergido algunos virus y han aparecido, en algunos casos, nuevas variantes con mayor virulencia y/o transmisibilidad. La participación de algunos de estos agentes víricos más nuevos en la etiología del complejo entérico está bien establecida, pero en muchos casos continúa siendo incierta. El objetivo general de la presente Tesis Doctoral fue investigar la relevancia de las infecciones por diferentes virus que han sido implicados en la etiología del complejo entérico en las granjas de cerdos de España. Las investigaciones desarrolladas se han recogido en un total de cinco publicaciones que abordan la prevalencia de diferentes virus entéricos en brotes de diarrea (estudio 1: publicaciones 1, 2 y 3) así como su caracterización genética (estudio 2: publicaciones 1, 2 y 3), el desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas de interés para el control de estas infecciones (estudio 3: publicación 4) y la caracterización de la infección y la inmunidad cruzada asociada a diferentes variantes del Virus de la diarrea epidémica porcina o VDEP detectadas en las explotaciones porcinas de España (estudio 4: publicación 5). En el estudio 1 se investigó la prevalencia, en granjas españolas, de los cinco coronavirus entéricos descritos hasta el momento en el hospedador porcino, de rotavirus de los tipos A, B, C y H, así como de astrovirus, kobuvirus, torovirus, orthorevirus y mastadenovirus. Para ello, se monitorizaron 206 brotes de enfermedad entérica en granjas de cerdos, siendo muy común la detección de uno o más de los virus entéricos investigados. Entre los coronavirus entéricos el VDEP fue el único detectado, en casi el 20 % de los brotes investigados y particularmente en la etapa de engorde. Por su parte, se detectaron rotavirus en uno de cada cuatro brotes investigados, fundamentalmente Rotavirus A (RVA) y en menor medida Rotavirus B (RVB) tras el destete y Rotavirus C (RVC) en los brotes de diarrea neonatal. Se identificó por primera vez en Europa la infección por Rotavirus H (RVH) en un total de 8 granjas porcinas españolas. Finalmente, se determinó la prevalencia de la infección por virus cuya relevancia en la etiología del complejo entérico no está bien establecida, confirmando la presencia de todos los virus investigados, con prevalencias que variaron entre el 48,5 % para los astrovirus y el 4,4 % para los orthoreovirus. La caracterización molecular de los principales virus implicados en la etiología del complejo entérico fue el objetivo del estudio 2. Se obtuvo la secuencia completa del gen de la proteína S de todos los aislados del VDEP, determinando las variantes de este virus más extendidas en nuestro país, todas ellas del genogrupo INDEL o G1b, entre las que destacó una variante recombinante que se ha convertido en mayoritaria en los años más recientes (rVDEP-SeCoV). Además, se obtuvieron mediante técnicas de secuenciación masiva las secuencias completas del genoma de aislados de VDEP (4), RVH (4), astrovirus (16), kobuvirus (3) y torovirus (1), investigando sus relaciones con aislados recuperados en otras regiones o en otros hospedadores diferentes del cerdo. En el estudio 3 se optimizó una herramienta de diagnóstico molecular rápida que permite discriminar entre virus viable o infeccioso y virus no viable, la PCR de viabilidad. Esta técnica permitió diferenciar el virus infeccioso del inactivado por calor en suspensiones virales del VDEP, así como en muestras de suero y tiene gran aplicabilidad en la monitorización de potenciales fuentes de infección implicadas en la transmisión de este coronavirus. Por último, en el cuarto y último estudio, se caracterizó la infección en cerdos destetados por el Coronavirus entérico porcino (SeCoV) -un virus quimérico originado por un evento de recombinación entre el Virus de la gastroenteritis transmisible (VGET) o su mutante el Coronavirus respiratorio porcino (CVRP) y el VDEP, progenitor mayor y menor respectivamente- y dos variantes del genogrupo G1b del VDEP, entre ellas la variante recombinante rVDEP-SeCoV que identificamos como predominante en España en los años más recientes en el estudio 2. El cuadro clínico y lesional fue el característico de las infecciones por coronavirus entéricos, prolongándose la excreción en heces durante el periodo de convalecencia para los tres virus investigados. La protección frente a la reinfección fue completa tras el desafío homólogo a las 3 semanas, tanto en lo que respecta a la presentación clínica como a la presencia de lesiones o la eliminación viral en heces. Sin embargo, el desafío heterólogo se asoció a una protección parcial, existiendo excreción en heces o incluso clínica de diarrea o lesiones en el intestino delgado. De forma global, los resultados de esta Tesis Doctoral demuestran la necesidad de una monitorización continua de los diferentes virus implicados en la etiología del complejo entérico porcino así como de nuevos estudios que permitan profundizar en el conocimiento de las enfermedades asociadas a la infección por algunos de estos agentes víricos.[EN] Strict control of infectious diseases is a major pillar in the sanitary and welfare standards that current and next future policies demand in swine production. Enteric diseases are among the main hazards challenging pig health, especially in the early stages of production and among them, the relative importance of viral pathogens is gaining relevance in recent years, both associated to the emergence of new aetiological agents and the re-emergence of well-known pathogens, some of which exhibit new variants with higher virulence and/or transmissibility. The general objective of this Doctoral Thesis was to investigate the relevance of infections by different enteric viruses which have been suggested as aetiological agents of enteric disease on pig farms in Spain. The results of our research have been included in five peer-review articles answering questions about the prevalence of different enteric viruses in diarrhoea outbreaks (study 1: articles 1, 2 and 3), viral genetic characterization (study 2: articles 1, 2 and 3), the development of new diagnostic tools of interest for the control of these infections (study 3: article 4) and the characterization of the infection and cross-immunity associated with different variants of Porcine epidemic diarrhoea virus or PEDV (study 4: article 5). Study 1 investigated the prevalence of the five enteric coronaviruses described to date in the porcine host, rotaviruses of types A, B, C and H, as well as astroviruses, kobuviruses, toroviruses, orthoreviruses and mastadenoviruses in 206 outbreaks of enteric disease on Spanish swine farms. The detection of one or more of the investigated enteric viruses was very common with prevalence values ranging from 48.5% for astroviruses to 4.4% for orthoreoviruses. Particularly, PEDV was the only coronavirus detected, in almost 20 % of the outbreaks investigated, particularly in the fattening stage. Rotaviruses were detected in one out of four outbreaks investigated, mainly Rotavirus A (RVA) and to a lesser extent Rotavirus B (RVB) after weaning and Rotavirus C (RVC) in neonatal diarrhoea outbreaks. Rotavirus H (RVH) was identified for the first time in Europe, circulating on nine of the Spanish pig farms investigated. The molecular characterization of the main viruses involved in the etiology of swine enteric disease was the objective of study 2. The complete sequence of the protein S gene of all PEDV isolates was obtained, identifying the most widespread variants of this coronavirus in Spain, all of them included in the INDEL or G1b genogroup. Particularly, a recombinant variant (rPEDV-SeCoV) was identified as the predominant PEDV isolate in recent years in Spain. In addition, the complete genome sequences of PEDV (4), RVH (4), astrovirus (16), kobuvirus (3) and torovirus (1) isolates were obtained by high throughput sequencing techniques, allowing for the investigation of their relationships with isolates recovered in other geographical regions or in hosts other than swine. A rapid molecular diagnostic tool to discriminate between viable or infectious virus and non-viable virus, viability PCR, was optimized in study 3. This technique differentiated infectious and heat-inactivated virus in PEDV viral suspensions as well as in serum samples and can be use in the monitoring of potential sources of infection involved in the transmission of this coronavirus. Finally, in the fourth and last study, infection in weaned pigs by Swine enteric coronavirus (SeCoV) -a chimeric virus originating from a recombination event between Transmissible gastroenteritis virus (TGEV) or its mutant Porcine respiratory coronavirus (PRVC) and PEDV- and two variants of PEDV G1b genogroup, including the recombinant variant between PEDV and SeCoV or rPEDV-SeCoV, were characterized. The clinical signs and lesions were similar to previous reports of enteric coronavirus infections regardless of the inoculum and faecal excretion during the convalescence period was observed for the three investigated isolates. Protection against reinfection was complete after homologous challenge at 3 weeks, both in terms of clinical disease and viral shedding. In contrast, heterologous challenge was associated with a partial protection, with viral excretion in faeces or even diarrhoea and lesions in the small intestine. Overall, the results of this Doctoral Thesis allow us to conclude that there is a need for a continuous monitoring of the different viruses involved in the aetiology of enteric disease in swine as well as the convenience of new studies to investigate the clinical relevance of the infection by some of these viral agents.Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentari