Développement de marqueurs fluorescents pour la microscopie super-résolution à température cryogénique

La microscopie à localisation de molécules uniques est une méthode puissante pour étudier les processus biologiques à une résolution nanométrique. Cependant, dans cette technique, les échantillons biologiques sont généralement fixés chimiquement pour éviter les mouvements. Comme la fixation chimique peut produire des artefacts à ces hautes résolutions, il est nécessaire de développer des stratégies de fixation alternatives. Une solution consiste à congeler les échantillons à une température cryogénique, ce qui présente également d'autres avantages, comme par exemple la possibilité de réaliser des études cryocorrélatives avec la cryo-EM. Un défi important est cependant le manque de marqueurs fluorescents capables de photocommuter efficacement à température cryogénique. Les fluorophores organiques qui sont généralement utilisés en microscopie ne peuvent pas être utilisés, car leur commutation est basée sur la diffusion des molécules du tampon STORM, qui est entravée en dessous de la température de transition vitreuse. En outre, peu de fluorophores organiques peuvent traverser la membrane des cellules vivantes, et une fixation chimique reste donc souvent nécessaire. A l’inverse, les protéines fluorescentes sont codées génétiquement et peuvent être exprimées directement avec la protéine d'intérêt et aucune fixation n'est donc nécessaire. Elles sont donc les meilleurs candidats pour être utilisées comme marqueurs fluorescents pour la microscopie de localisation de molécules uniques à température cryogénique, mais des stratégies pour les photocommuter plus efficacement sont nécessaires, car leur flexibilité conformationnelle est réduite à cette température.Nous avons réalisé des études spectroscopiques et structurales sur la protéine fluorescente rsEGFP2 et nous avons également étudié d'autres protéines (rsEGFP2-V151A, rsEGFP2-V151L, mEmerald et EGFP) à température ambiante et à température cryogénique afin de comprendre leurs mécanismes de photocommutation Nous avons développé une stratégie d'illumination pour améliorer leur retour de l'état non-fluorescent à l'état fluorescent à température cryogénique. Nous avons observé que pour rsEGFP2, le mécanisme de photocommutation cryogénique est structuralement et spectroscopiquement différent du mécanisme à température ambiante. Contrairement à une isomérisation cis-trans à température ambiante, aucun changement structural majeur entre l'état fluorescent et l'état non-fluorescent n'a été observé par cristallographie aux rayons X à température cryogénique. Les études de microspectrophotométrie d'absorbance et de fluorescence ont mis en évidence deux états non-fluorescents différents qui se produisent lors de la photocommutation cryogénique, tous deux décalés vers le bleu par rapport à l'état non-fluorescent observé après la commutation à température ambiante. Avec le laser 405 nm généralement utilisé, seul l'un des états non-fluorescents peut être ramené à l'état fluorescent. Nous avons observé qu'avec un laser 355 nm, les deux états non-fluorescents sont récupérables, ce qui permet d'améliorer significativement le retour de l'état fluorescent. Il est intéressant de noter que la photocommutation de mEmerald et d'EGFP aux températures ambiantes et cryogéniques semble très similaire à la commutation de rsEGFP2 à température cryogénique, ce qui indique que ce nouveau mécanisme de commutation pourrait être général aux protéines de la famille GFP. L'utilisation d'un laser de 355 nm pour activer des protéines fluorescentes comme rsEGFP2, mEmerald et EGFP à cryo-température pourrait permettre d'obtenir un marquage effectif plus efficace dans les applications de microscopie de localisation de molécules uniques à cryo-température.Single-molecule localization microscopy is a powerful tool for studying biological processes at nanoscale resolution. However, in this technique, biological samples are typically fixed chemically to avoid motion blur. As the chemical fixation may produce artifacts at these high resolutions, alternative fixation strategies are of high demand. One solution is to freeze the samples at cryo-temperature, which also has other advantages as for example the possibility of performing cryo-correlative studies with cryo-EM. The main challenge of sample-freezing is the lack of fluorescent markers which can undergo efficient photo-switching at cryo-temperature. Organic dyes which are typically used in stochastic super-resolution microscopy cannot be used, because their switching is based on diffusion of STORM buffer molecules, which is hampered below the glass transition temperature. In addition, few organic fluorophores can cross the membrane of living cells, so chemical fixation is often necessary, even at cryogenic temperature. In contrast, fluorescent proteins are genetically encoded and can be expressed directly with the protein of interest and thus no fixation is necessary. Hence, they are the best candidates to be used as fluorescent markers for single-molecule localization microscopy at cryogenic temperature. However, strategies to photo-switch them more efficiently are required, as their conformational flexibility is reduced at such temperature.We performed spectroscopic and structural investigations on the fluorescent protein rsEGFP2 and also studied other proteins (rsEGFP2-V151A, rsEGFP2-V151L, mEmerald and EGFP) at room- and cryo-temperature in order to understand their switching mechanisms, and we developed an illumination strategy to enhance their recovery from non-fluorescent to fluorescent states at cryo-temperature. We observed, that for rsEGFP2, the cryo-switching mechanism is structurally and spectroscopically different from the mechanism at room temperature. In contrast to a cis-trans isomerization at room temperature, no major structural changes between the on- and off-states were observed by X-ray crystallography for switching at cryogenic temperature. The absorbance and fluorescence microspectrophotometry investigations revealed two off-states arising upon cryo-off-switching, both blue shifted as compared to the off-state which is observed after room temperature switching. With the typically used 405 nm laser only one of the off-states is recoverable to the fluorescent on-state. We observed that with a 355 nm laser both off-states are recoverable and thus achieve a substantial enhancement of total recovery of the fluorescent state. Interestingly, the switching of mEmerald and EGFP at cryo- and room-temperature appear to be very similar to the rsEGFP2 switching at cryo-temperature, which indicates that this new switching mechanism could be general to proteins of the GFP family. Using a 355 nm laser for activating fluorescent proteins like rsEGFP2, mEmerald and EGFP at cryo-temperature could open the door to more efficient effective labeling in single-molecule localization microscopy applications at cryo-temperature