Étude mécaniste des complexes du divisome corynébacterien impliqués dans la séparation cellulaire

Chez les bactéries, la division cellulaire est un processus coordonné par un complexe multiprotéique appelé divisome. L'assemblage du divisome s'effectue à partir d'une protéine bactérienne très conservée, FtsZ, un homologue de la tubuline qui polymérise pour former une structure annulaire dynamique, le Z-ring, marquant le futur site de division. Le Z-ring recrute alors de manière séquentielle les protéines structurales et auxiliaires qui constitueront la machinerie de division à même de réorganiser la paroi cellulaire. Ce complexe de protéines transmembranaires coordonne d'une part la synthèse centripète de peptidoglycane (le composant majeur de la paroi cellulaire des bactéries) par les penicillin-binding proteins, et d'autre part la dégradation périphérique du peptidoglycane par des enzymes autolytiques, pour permettre la séparation de deux cellules filles viables (septation). Malgré un schéma général d'assemblage et de fonctionnement du divisome très conservé, d'importantes spécificités existent au sein des bactéries, vraisemblablement pour accommoder leur richesse caractéristique en termes de morphologies, de modes de croissance, et de compositions de paroi cellulaire. C'est particulièrement vrai chez les Corynebacteriales, un groupe d'actinomycètes incluant d'importants pathogènes comme Mycobacterium tuberculosis et Corynebacterium diphtheriae. Les Corynebacteriales présentent un mode de croissance polaire et une paroi à l'organisation complexe, entourée d'une couche d'acides mycoliques. La septation se fait chez les Corynebacteriales via un processus de rupture rapide et brutale des parois des deux cellules filles appelé V-snapping. L'objectif de cette thèse est la caractérisation structurale et fonctionnelle du divisome chez les Corynebacteriales. Nous nous sommes ici concentrés sur RipA, une enzyme clef de la séparation cellulaire chez les Corynebacteriales. RipA est une autolysine qui catalyse le clivage des liaisons peptidiques transversales au sein du peptidoglycane, et qui a été montrée comme importante dans les mécanismes de virulence de M. tuberculosis et C. diphtheriae. Nous avons caractérisé la structure complète de l'homologue de RipA chez Corynebacterium glutamicum, qui montre l'enzyme dans une conformation auto-inhibée assurée par son domaine N-terminal en superhélice. Nous avons pu ensuite montrer que RipA fonctionne en synergie avec deux protéines nouvellement caractérisées impliquées dans la division cellulaire et spécifiques des Corynebacteriales, SteA et SteB. La structure crystalline du domaine extracytosolique de SteB nous a permis de construire un modèle putatif d'interaction avec RipA. Nous avons généré une souche de C. glutamicum délétée de steA, ce qui nous a permis de de reconstituer le protéome de SteA par immuno-précipitation. L'analyse du protéome de SteA nous a permis d'émettre des hypothèses quant à l'intégration de SteA et SteB dans le processus de division cellulaire chez les Corynebacteriales. Étant donné que les déplétions des différentes protéines impliquées dans la division cellulaire sont connues pour augmenter la sensibilité aux antibiotiques des Corynebacteriales, nous espérons que ces travaux pourront conduire à l'avenir à la conception rationnelle de nouveaux médicaments qui pourraient agir en synergie avec les antibiotiques existants.Bacterial cell division is a temporally and spatially regulated process coordinated by a multiprotein complex called the divisome. The assembly of the divisome is initiated and organized by the highly conserved bacterial tubulin homologue FtsZ, which polymerizes to form a dynamic ring structure (Z-ring) that marks the site of cell division. Following ring assembly, FtsZ recruits structural and accessory proteins in an ordered manner to form the functional cell division machinery that will rearrange the cell wall. This transmembrane protein complex will coordinate the inward synthesis of peptidoglycan (the major component of the cell wall) by penicillin-binding proteins with its peripheral degradation by autolytic enzymes to allow the separation of two viable daughter cells (septation). Although the general scheme of divisome assembly and function seems to be widely conserved in bacteria, important species-specific differences exist to satisfy different morphologies, growth modes and cell wall compositions. This is particularly true in Corynebacteriales, an order of Actinobacteria including important human pathogens such as Mycobacterium tuberculosis and Corynebacterium diphtheriae. Corynebacteriales have an unusual polar elongation mode and a complex cell wall surrounded by a mycolic acid layer. Corynebacteriales septation is performed through a fast, brutal rupture of the cell walls of the two daughter cells called V-snapping. The goal of the present thesis was the structural and functional characterization of the divisome in Corynebacteriales. We focused on RipA, a key enzyme for cell separation in Corynebacteriales. RipA is an autolysin which catalyzes the cleavage of the peptidic cross-links of peptidoglycan and has been shown to be important for virulence of M. tuberculosis and C. diphtheriae. We characterized the structure of the full-length Corynebacterium glutamicum homologue of RipA, which revealed the enzyme in an auto-inhibited conformation mediated by its N-terminal coiled-coil domain. Further work allowed us to show that RipA works in synergy with the newly characterized, Corynebacteriales-specific division proteins SteA-SteB. The crystal structure of the extracytosolic domain of SteB allowed us to build a putative mode of interaction with RipA. We generated a C.glutamicum strain knocked-out for steA which allowed us to reconstitute the proteome of SteA by immunoprecipitation. The analysis of the proteome of SteA gave us insights into how SteA and SteB are integrated into the cell division process in Corynebacteriales. Since depletions of the different proteins involved in cell separation are known to increase antibiotics susceptibility in Corynebacteriales, we hope this work could lead in the future to the rational design of new drugs which could act in synergy with existing antibiotics