Conception of cocktails from bacteria and fungi co-cultures for new biofungicides

Le genre Fusarium est à l'origine de pathologies végétales concernant une grande variété de cibles avec des conséquences sur les rendements et la santé des consommateurs. Parmi elles, F. graminearum et F. oxysporum ont le plus d'impact économique et les moyens de lutte durables contre ces pathogènes sont actuellement limités. Le biocontrôle est une solution alternative aux pesticides de synthèse. Cependant, il est difficile d'exploiter pleinement le potentiel existant dans la nature. Un moyen de découvrir de nouvelles molécules d'intérêt est la co-culture. Impliquant deux ou plusieurs populations de cellules, elle recrée des interactions non existantes en monocultures. Ce projet de thèse, a ainsi eu pour but de mettre en présence des bactéries et des champignons possédant des activités connues, et ainsi de découvrir des associations produisant des cocktails de molécules antifongiques afin de lutter contre des phytopathogènes.Le projet a débuté par la sélection rationnelle de microorganismes ayant une activité antifongique rapportée dans la littérature : cinq bactéries (Bacillus subtilis, Pseudomonas syringae, Dietzia sp., Streptomyces coelicolor, Streptomyces sp.) et cinq champignons (Pseudozyma aphidis, Trichoderma harzianum, Aspergillus oryzae, Cladosporium cladosporioides et F. oxysporum) ont été retenus. Par la suite, des conditions de culture (milieu, température) adéquates pour réaliser des co-cultures et permettre la croissance des deux partenaires impliqués ont été définies et trois milieux ont été choisis : deux milieux riches (LB, NB) et un milieu minimum (GMM).Après cette sélection, des essais dans un microbioréacteur (BioLector) ont été réalisés : ces derniers impliquaient les dix microorganismes sélectionnés en monocultures et vingt-cinq co-cultures dans les trois conditions de milieu. Un criblage de l'activité antifongique des surnageants de culture générés a été réalisé contre une souche de F. oxysporum issue de l'environnement et S. cerevisiae. Treize co-cultures sur vingt-cinq ont montré une activité contre au moins l'une des deux cibles. Après ces tests, la sélection de couples d'intérêt a été réduite de vingt-cinq à dix. Ces couples ont été cultivés dans des volumes de 50 mL dans les milieux LB et NB qui ont montré la meilleure activité dans les conditions choisies, et leurs surnageants testés pour leur activité antifongique. Ces tests ont permis d'affiner le choix et de se focaliser sur six couples : P. syringae + A. oryzae, Streptomyces sp. + A. oryzae, P. syringae + F. oxysporum, P. syringae + P. aphidis, Dietzia sp. + T. harzianum, Streptomyces sp. + C. cladosporioides. Ces six couples ont fait l'objet d'une série de cultures et de tests de surnageants sur boîte et en liquide (contre F. oxysporum). Trois couples ont présenté une activité plus prononcée, en particulier contre F. oxysporum et se sont démarqués des monocultures : Streptomyces sp. + A. oryzae, Streptomyces sp. + C. cladosporioides et P. syringae + A. oryzae. La co-culture Streptomyces sp. + C. cladosporioides a présenté une activité synergique propre à inhiber ou ralentir la croissance de F. oxysporum par rapport aux monocultures seules, tandis que P. syringae + A. oryzae et Streptomyces sp. + A. oryzae ont présenté une activité additive contre F. oxysporum.Pour les trois couples retenus, les molécules produites et sécrétées ont été étudiées par protéomique et métabolomique. Quelle que soit la co-culture considérée, celle-ci induit l'activation de gènes restés silencieux en monoculture. On peut ainsi observer l'expression d'une très grande proportion de protéines ou de métabolites secondaires (38 à 50%) exclusivement présentes dans les surnageants de co-cultures. En outre, parmi les molécules sécrétées de novo dans les co-cultures, certaines connues pour leurs activités antimicrobiennes voire antifongiques ont pu être identifiées et ceci pour les trois couples étudiés.The genus Fusarium causes plant pathologies affecting a wide variety of targets with consequences on yields and consumer health. Among them, F. graminearum and F. oxysporum have the most important economic impacts and sustainable control methods against these pathogens are currently limited. Biocontrol is an alternative to synthetic pesticides. However, it is difficult to fully exploit the potential that exists in nature. One way to discover new molecules of interest is co-culture. Involving two or more populations of cells, it recreates interactions that do not exist in monocultures. The aim of this thesis project was to bring together bacteria and fungi with known activities, and thus to discover associations producing cocktails of antifungal molecules to fight against phytopathogens.The project started with the rational selection of microorganisms with antifungal activity reported in the literature: five bacteria (Bacillus subtilis, Pseudomonas syringae, Dietzia sp., Streptomyces coelicolor, Streptomyces sp.) and five fungi (Pseudozyma aphidis, Trichoderma harzianum, Aspergillus oryzae, Cladosporium cladosporioides, and F. oxysporum) were chosen. Subsequently, culture conditions (medium, temperature) adequate to perform co-cultures and allow the growth of both partners involved were defined and three media were chosen: two rich media (LB, NB) and one minimal medium (GMM).After this selection, tests in a microbioreactor (BioLector) were carried out: these involved the ten selected microorganisms in monocultures and twenty-five co-cultures in the three media conditions. A screening of the antifungal activity of the generated culture supernatants was performed against an environmental strain of F. oxysporum and S. cerevisiae. Thirteen out of twenty-five co-cultures showed activity against at least one of the two targets. After these tests, the selection of co-cultures of interest was reduced from twenty-five to ten. These co-cultures were grown in 50 mL volumes in LB and NB media that showed the best activity under the chosen conditions, and their supernatants tested for antifungal activity. These tests allowed to refine the choice and to focus on six couples: P. syringae + A. oryzae, Streptomyces sp. + A. oryzae, P. syringae + F. oxysporum, P. syringae + P. aphidis, Dietzia sp. + T. harzianum, Streptomyces sp. + C. cladosporioides. These six couples were subjected to a series of cultures and their supernatants tested on agar plates and in liquid media (against F. oxysporum). Three co-cultures showed a more pronounced activity, especially against F. oxysporum and stood out from the monocultures: Streptomyces sp. + A. oryzae, Streptomyces sp. + C. cladosporioides and P. syringae + A. oryzae. The Streptomyces sp. + C. cladosporioides co-culture showed synergistic activity in inhibiting or slowing the growth of F. oxysporum compared to monocultures alone, while P. syringae + A. oryzae and Streptomyces sp. + A. oryzae showed additive activity against F. oxysporum.For the three selected couples, the molecules produced and secreted were studied by proteomics and metabolomics. Whatever the co-culture considered, it induces the activation of genes that remained silent in monoculture. Thus, we can observe the expression of a very high proportion of proteins or secondary metabolites (38 to 50%) exclusively present in the supernatants of co-cultures. Moreover, among the molecules secreted de novo in the co-cultures, some known for their antimicrobial or even antifungal activities could be identified for the three couples that were studied