Molecular mechanisms involved in ribosome protection against antibiotics

Le travail effectué se concentre sur la caractérisation d’un mécanisme de résistance décrit chez E. faecium. La mutation d'un seul nucléotide sur le gène eat(A) conduit à la substitution d'un acide aminé (T450I) codant pour la forme variante de la protéine Eat(A)v. Cette mutation entraîne une résistance croisée pour différents antibiotiques (Lincosamides, Streptogramines A et Pleuromutilines) qui ciblent tous le centre de transfert peptidique du ribosome. Eat(A) fait partie des protéines ABC-F dont certaines sont des Protéines de Protection du Ribosome, alors que le rôle de la forme sauvage reste inconnu. L’objectif de cette thèse est de caractériser l’activité biologique des deux formes de la protéine Eat(A). La mutation à l'origine du phénotype de résistance est située 3 résidus en amont de l'un des deux sites d'hydrolyse de l'ATP. Une différence dans l'activité ATPase entre la forme native et la forme variante de la protéine peut être à l'origine du mécanisme de résistance. Pour répondre à ces questions, nous avons mis au point une méthode de purification pour obtenir suffisemment de protéine soluble pour effectuer des essais in vitro. Nous avons étudié l'impact de la mutation T450I sur l'activité ATPase des protéines, révélant l’importance de l’isoleucine dans l’activité biologique. Nous avons également développé un système de traduction in vitro à partir d’extraits S30 d’E. faecium pour étudier l'impact des deux protéines Eat(A) sur la traduction en suivant la synthèse de la GFP, avec ou sans antibiotiques. Enfin, nous avons entrepris la caractérisation des interactions entre les deux formes d'Eat(A) et le ribosome d'E. faecium en utilisant la technologie cryo-EM.The work carried out focuses on the characterisation of a resistance mechanism described in E. faecium. A single nucleotide mutation in the eat(A) gene leads to the substitution of an amino acid (T450I) coding for the variant form of the Eat(A)v protein. This mutation leads to cross-resistance to different antibiotics (Lincosamides, Streptogramins A and Pleuromutilins) which all target the peptide transfer centre of the ribosome. Eat(A) is one of the ABC-F proteins, some of which are Ribosome Protection Proteins, while the role of the wild type remains unknown. The aim of this thesis is to characterise the biological activity of the two forms of the Eat(A) protein. The mutation causing the resistance phenotype is located 3 residues upstream of one of the two ATP hydrolysissites. A difference in ATPase activity between the native and the variant form of the protein may be at the origin of the resistance mechanism. To address these questions, we developed a purification method to obtain sufficient soluble protein for in vitro assays. We studied the impact of the T450I mutation on the ATPase activity of the proteins, revealing the importance of isoleucine in the biological activity. We also developed an in vitro translation system using E. faecium S30 extracts to study the impact of the two Eat(A) proteins on translation by monitoring GFP synthesis, with or without antibiotics. Finally, we undertook the characterisation of the interactions between the two forms of Eat(A) and the E. faecium ribosome using cryo-EM technology