Caractérisation de nouveaux facteurs de la réparation des cassures double-brin de l'ADN dans les lymphocytes B

La diversité génétique des récepteurs d'antigènes des lymphocytes B repose sur deux processus de recombinaison site-spécifique de l'ADN : la recombinaison V(D)J qui est initiée dans les cellules B immatures par la nucléase RAG (Recombination activating genes 1 et 2) et la commutation isotypique (class switch recombination, CSR) qui est induite dans les cellules B matures par la cytidine désaminase AID (activation induced cytidine deaminase). Des erreurs lors de ces processus de recombinaison peuvent avoir un impact sur le développement des lymphocytes et peuvent aussi provoquer une instabilité du génome conduisant à des syndromes d'immunodéficience plus ou moins sévère et au développement de cancers lymphoïdes. Les cassures doubles brins de l'ADN (CDB) générées par ces enzymes induisent une réponse cellulaire dépendante de la protéine kinase Ataxia telangectasia mutated (ATM) lors de laquelle la protéine 53BP1 s'accumule aux sites endommagés pour favoriser la réparation de type jonction d'extrémités non-homologues (non-homologous end-joining, NHEJ). Alors que la recombinaison V(D)J et la CSR toutes deux monopolisent la voie 53BP1-NHEJ pour la réparation des CDB induites, ces deux réactions semblent avoir des modes de régulation différents. En effet, alors que la recombinaison V(D)J peut avoir lieu sans la protéine 53BP1, le CSR est fortement impacté par une déficience en 53BP1. Récemment, notre laboratoire et d'autres groupes avons identifié deux nouvelles protéines de la réparation des CDB, C20orf196 (SHLD1) et FAM35A (SHLD2), qui forment avec REV7 (également appelée MAD2L2) et CTC-534A2.2 (SHLD3) le complexe shieldin qui agit en aval de 53BP1 pour promouvoir la réparation par NHEJ. Au cours de mon travail de thèse, j'ai investigué le rôle de SHLD1, SHLD2 et MAD2L2 dans la recombinaison V(D)J et la CSR. Pour ce faire, j'ai inactivé génétiquement Shld1, Shld2 et Mad2l2 dans deux systèmes cellulaires permettant la modélisation de la recombinaison V(D)J et le CSR, respectivement les cellules de type immature pro-B immortalisées par la kinase Abelson (v-abl) et les cellules B CH12F3. J'ai montré que les protéines SHLD1, SHLD2 et MAD2L2 sont essentielles pour la CSR mais dispensables pour la recombinaison de la V(D)J. j'ai aussi montré qu'une diminution de l'expression de TRIP13, un régulateur nouvellement identifié de MAD2L2-Shieldin, n'a pas d'impact sur la recombinaison V(D)J. Enfin, en utilisant un modèle murin de déficience de SHLD1, j'ai confirmé que les cellules immortalisée v-Abl pro-B Shld1-/- ont une recombinaison V(D)J normale. Dans une deuxième partie de mon travail, j'ai testé si le complexe shieldin pouvait avoir des fonctions redondantes avec le facteur du NHEJ XLF lors de la réparation des CDB induites par RAG. J'ai pour ce fait généré une série de clones de cellules v-Abl pro-B déficients pour 53BP1-shieldin et/ou XLF et j'ai testé la recombinaison V(D)J dans ces différents clones. J'ai ainsi montré que les cellules inactivées pour XLF et SHL2, REV7 et 53BP1 ont une recombinaison V(D)J défectueuse par rapport aux clones cellulaires B inactivés pour XLF et SHLD1. Dans l'ensemble, mes études apportent de nouvelles connaissances sur les mécanismes de diversification des gènes codants pour les récepteurs d'antigènes des lymphocytes et, en particulier, démontrent que l'axe 53BP1-Shieldin joue des fonctions uniques lors de la réparation des CDB générées par les enzymes RAG et AID.Antigen receptor gene diversity in B lymphocytes relies on two site-specific DNA recombination processes - V(D)J recombination, which is triggered in immature B cells by recombination activating genes (RAG) 1 and 2 and class-switch recombination (CSR), which is induced by activation-induced cytidine deaminase (AID) in mature B cells. Failure or defects in RAG- or AID-mediated antigen receptor gene recombination may impact lymphocyte development and can potentially cause genome instability leading to immunodeficiencies and oncogenesis. DNA double-strand breaks generated by these enzymes activate the ataxia-telangiectasia mutated (ATM)-dependent DNA damage response (DDR) in which the chromatin-bound protein 53BP1 accumulates at damaged sites to promote non-homologous end-joining (NHEJ) repair. Interestingly, V(D)J recombination and CSR reactions distinctly rely on 53BP1-NHEJ for the repair of induced DSBs, indicating that unique regulatory mechanisms underlie RAG- and AID-induced DSB repair. Recently, we and others identified two novel DNA repair proteins, C20orf196 (SHLD1) and FAM35A (SHLD2), that form with REV7 (also called MAD2L2) and CTC-534A2.2 (SHLD3) the shieldin complex that acts downstream of 53BP1/RIF1 to promote NHEJ. During my thesis work, I tested the relative contribution of SHLD1, SHLD2 and MAD2L2 in V(D)J recombination and CSR. To do this, I genetically inactivated Shl1, Shld2 and Mad2l2 in CH12F3 B cells and Abelson kinase (v-abl) immortalized pro-B cells, which represent two model cellular systems of CSR and V(D)J recombination, respectively. I showed that SHLD1, SHLD2 and MAD2L2 are critical for CSR but dispensable for V(D)J recombination. In support to the later observation, I showed that the downregulation of TRIP13, a newly identified regulator of MAD2L2-Shieldin, does not impact on V(D)J recombination. Finally, using a mouse model of SHLD1 deficiency, I confirmed that Shld1 null v-abl pro-B cells perform normal V(D)J recombination. In addition, previous work showed that combined deficiency in 53BP1 and the NHEJ factor XLF leads to a severe defect in V(D)J recombination that is not observed in single mutants, indicating that these two factors have redundant functions during RAG-induced DSB repair. Thus, to test whether the shieldin complex might have similar redundant functions with XLF during RAG-DSB repair, I generated a series of Shieldin/XLF double mutant v-abl pro-B cell clones and tested V(D)J recombination in these settings. Interestingly, my results indicate that dual deficiency for XLF and SHL2 or REV7 but not SHLD1 leads to defective V(D)J recombination as compared to individual knockout B cell clones. Overall, my studies provide new insights into the mechanisms of antigen receptor gene diversification and, specifically, demonstrates that the 53BP1-Shieldin axis play unique functions during repair of AID- and RAG-generated DSBs