Nouvelles approches pour la caractérisation sur cellules uniques du microenvironnement tumora dans les cancers solides

La caractérisation de l'hétérogénéité du microenvironnement tumoral et des interactions cellulaires en son sein reste un défi important en oncologie. Elle nécessite l'identification de signaux moléculaires multiples (ADN, ARN, protéines) et leur localisation spatiale tout autant cellulaire qu’intratissulaire. Comprendre les signaux à la base des interactions cellulaires centrales dans la progression tumorale, permet d’envisager de surmonter les mécanismes d’adaptation dans les tumeurs.L'analyse de cellules unique est un outil indispensable pour l’étude de l'hétérogénéité des tissus qui n'est pas accessible lors de l'analyse groupée de cellules. Les techniques actuelles de séquençage sur cellules unique sont très performantes et donnent accès, à haut débit, à des informations « omiques » (génomiques, épigénomiques et transcriptomiques) pour chaque cellule. Toujours à l'échelle de la cellule unique et à haut débit, les analyses phénotypiques (protéome, sécrétome, morphologie, métabolisme, réponse aux stimuli…) sont possibles par microscopie ou cytométrie. Des techniques récentes permettent de coupler l'analyse de protéines ciblées à une analyse transcriptomique via le séquençage de nouvelle génération (NGS).Il existe aujourd'hui un besoin fort, exprimé par la communauté scientifique, d'une meilleure compréhension des systèmes biologiques complexes et hétérogènes. La génération de protéines fonctionnelles à partir de l’ARN est un processus complexe, en plusieurs étapes, ne présentant pas de corrélation directe entre l'expression transcriptomique et protéique. Il n'existe actuellement aucun système permettant l’acquisition à haut débit, d'informations à la fois phénotypiques et omiques pour chaque cellule.Dans cette thèse, je décris une plateforme microfluidique innovante pour l’analyse multimodale sur cellules uniques intégrant le phénotype cellulaire obtenu par imagerie optique et les données « omiques » via NGS. Les cellules sont isolées dans des microcages constituées d'un hydrogel expansible permettant la visualisation, le marquage et l'analyse fonctionnelle des cellules suivis de l’étiquetage et du séquençage de leur matériel génétique. L'utilisation d'un hydrogel thermosensible permet d'injecter et d'isoler, à la demande, une population de cellules tout en assurant une étanchéité biologique entre chaque compartiment. J'y décris les étapes de développement et une preuve de concept couplant analyse transcriptomique et imagerie de marqueurs intracellulaires sur des lignées cellulaires humaines et murines.Les techniques « omiques » nécessitent toujours une dissociation du tissu ne permettant pas de conserver l’information de localisation des cellules dans l'échantillon de départ. Ainsi, j'introduis une méthode permettant l'analyse « omique » sur cellules uniques de milliers de cellules d'une coupe de tissu avec une résolution spatiale de quelques dizaines de cellules, ou moins. La méthode consiste à attribuer, par diffusion, des acides nucléiques de localisation à des zones d’une coupe de tissu. Les cellules portant les mêmes acides nucléiques se trouvent dans la même zone ce qui permet, après séquençage des cellules uniques, de reconstruire l'organisation spatiale des cellules avant la dissociation de l'échantillon biologique. Différentes proportions d'acides nucléiques de localisation permettent d'estimer la distance d'origine entre les cellules, basée sur le principe de triangulation. Je démontre la faisabilité de l'amplification, de la diffusion et de la capture d'acides nucléiques par amplification isotherme, sur une coculture en 2D.Ce travail démontre, pour la première fois, qu’il est possible de combiner l'analyse à haut débit du phénotype et des acides nucléiques de chaque cellule d’un tissu biologique tout en conservant la connaissance de leur organisation d'origine. Ces technologies pourront s’avérer déterminantes dans la compréhension de l’hétérogénéité tumoral ou d’autres systèmes biologiques complexes.The characterisation of the heterogeneous tumour microenvironment and its complex cellular interactions remains an important challenge in oncology. Understanding those requires the identification of the multiple molecular signals (DNA, RNA, proteins) both within or on the cells as well as their intra-tissue spatial location. Then, understanding the basis of these interactions, which have a major role in the survival or death of tumour cells, opens the door to overcoming the mechanisms of adaptation taking place in the tumour system.Single-cell analysis is an indispensable tool to access cellular heterogeneity of healthy and diseased tissues which cannot be retrieved when analysing a group of cells in bulk.Current single-cell sequencing techniques are very powerful by providing access to ‘omic’ information (genomic, epigenomic and transcriptomic analyses) for each of the cells in a sample, at high-throughput. Similarly, phenotypic analyses (proteome, secretome, morphology, metabolism, cellular response to external stimuli…) are also possible at high-throughput at the single-cell level, using microscopy, flow-cytometry and mass-cytometry. Additionally, some recent techniques even allow the analysis of a sub-fraction of the proteome displayed on the cell surface, coupled with transcriptomic analysis via next generation sequencing (NGS).However, the research and clinical communities are presently expressing a strong need for a better understanding of complex and heterogeneous biological systems. Generation of functional proteins is a complex, multi-step, cellular state dependent process, which prevents a direct correlation between transcriptomic and protein expression. Currently, no system allows the combined acquisition of both phenotypic and omics information for each single cell of a biological sample composed of thousands of cells.In this thesis, I describe an innovative microfluidic platform to run multimodal single-cell analyses with one-to-one mapping of cellular phenotype obtained by optical imaging onto ‘omic’ data via barcoded NGS. Single cells are isolated in micro-cages made of a thermo-expandable hydrogel allowing visualisation, labelling and functional analysis of the cells identified by the barcoding and sequencing of their genetic material. The use of a thermo-sensitive hydrogel gives the ability to introduce and isolate, on demand, a population of cells while providing a biological seal between each cell. I describe the development steps and show a biological proof of concept by coupling single-cell transcriptomic analysis and intracellular marker imaging on human and murine cell lines.One of the major limitations of ‘omic’ techniques is that they require tissue dissociation leading to the loss of localisation information for each of the cells in the starting sample. I introduce a method allowing single-cell ‘omic’ analysis of thousands of cells from a tissue slide with a spatial resolution of a few dozen cells, or less. The solution involves using diffusion to assign localisation nucleic acids to areas of tissue section. The cells carrying the same nucleic acids are found in the same area which makes it possible, after single-cells sequencing, to reconstruct the spatial organisation of the cells before dissociation of the biological sample. Based on the principle of triangulation, different proportions of specific localisation nucleic acids allow estimating the original distance between cells. On a 2D co-culture, I demonstrate the feasibility of isothermal localisation nucleic-acid amplification, diffusion and capture.This work demonstrates that, for the first time, it can be possible to combine high-throughput analysis of the phenotype and the nucleic acids of each cell of a biological tissue sample while knowing their original organisation. These technologies will be instrumental in tackling the heterogeneity of the tumour microenvironment or the complexity of other biological systems