Targeted molecular markers for the prognosis of adrenocortical carcinoma : from genomics to personalized medicine

Les carcinomes de la corticosurrénale, ou corticosurrénalomes, sont des cancers rares de pronostic sombre, avec un taux de survie à 5 ans inférieur à 40%. L'évaluation pronostique est un élément essentiel de la prise en charge de ces tumeurs. Les principaux facteurs pronostiques sont l'extension tumorale et l'index de prolifération Ki67. Cependant, le pronostic reste hétérogène et difficile à prédire à l'échelle individuelle. Récemment, les études de génomique ont identifié des sous-groupes de corticosurrénalomes sur la base de leurs altérations moléculaires, qui s'associent à des pronostics différents. Un premier groupe est caractérisé par un profil transcriptome « C1A » (signature de prolifération), un profil méthylome « CIMP » (hyperméthylation des îlots CpG), un profil d'altérations chromosomiques « Noisy » (nombreuses cassures chromosomiques) et des mutations récurrentes des gènes des voies p53/Rb et Wnt/ß-caténine. Ce groupe est associé à un mauvais pronostic. Un deuxième groupe est caractérisé par un profil transcriptome « C1B » (signature immune), un profil méthylome « non-CIMP », un profil d'altérations chromosomiques « Chromosomal » (pertes d'hétérozygotie étendues sur plusieurs bras chromosomiques) ou « Quiet » (peu d'altérations) et de rares mutations somatiques. Ce groupe est associé à un pronostic meilleur. La mesure ciblée de l'expression de 2 gènes (BUB1B-PINK1) en RT-qPCR a été proposée comme marqueur pronostique dérivé du transcriptome pour le transfert clinique. Dans la continuité de ces travaux réalisés par mon laboratoire d'accueil, ce travail de thèse vise à développer, à partir des études de génomique, des marqueurs moléculaires utilisables en routine pour l'évaluation pronostique. Dans une première partie, nous avons proposé un marqueur pronostique dérivé du méthylome, consistant en la mesure ciblée de la méthylation de 4 gènes (PAX5, PAX6, PYCARD, GSTP1) par MS-MLPA. Dans une deuxième partie, nous montré que la classe moléculaire pouvait être résumée par différentes combinaisons de marqueurs moléculaires ciblés : soit une combinaison ARN + ADN tumoral, intégrant marqueur ARN BUB1B-PINK1, mesures ciblées de méthylation et d'altérations chromosomiques ; soit, en l'absence de tissu congelé disponible pour l'étude de l'ARN tumoral, une combinaison uniquement basée sur l'ADN, intégrant mesures ciblées de méthylation, d'altérations chromosomiques et mutations des gènes des voies p53/Rb et Wnt/ß-caténine. Dans les corticosurrénalomes localisés, l'association du stade, du grade tumoral et de la classe moléculaire fournissait la meilleure discrimination pronostique. Dans une troisième partie, nous avons étudié l'hétérogénéité intratumorale des marqueurs pronostiques ADN et montré que les mutations somatiques et la mesure ciblée de méthylation pouvaient varier d'une région tumorale à l'autre. La combinaison de différents marqueurs cliniques et moléculaires semble donc préférable à l'utilisation d'un marqueur ADN unique pour l'évaluation pronostique. Enfin, dans une quatrième partie, nous avons étudié le transcriptome sur des tissus en paraffine, en utilisant un nouveau protocole de séquençage des extrémités 3' de l'ARN. Les extrémités 3' de l'ARN sont en effet plus résistantes à la dégradation induite par la fixation et l'inclusion en paraffine. Nous avons montré que le protocole de séquençage ARN 3' identifie les profils transcriptome « C1A » et « C1B » et constitue une solution adaptée pour l'évaluation pronostique sur des échantillons en paraffine. Ces travaux établissent la classe moléculaire comme un élément incontournable de l'évaluation pronostique des corticosurrénalomes. Plusieurs déclinaisons de marqueurs ciblés sont proposées pour le transfert en routine, en fonction des techniques et du matériel tumoral disponibles. Pour l'avenir, la détermination du transcriptome sur paraffine offre la perspective d'une intégration de la médecine génomique dans le soin courant.The prognosis of adrenocortical carcinoma (ACC) is globally poor, with 5-year overall survival below 40%, but varies widely. Prognostic stratification is critical for patients care. Standard prognostic factors mainly include tumor stage and Ki67 proliferation index. However, the risk stratification based on tumor these factors is limited. Recently, pangenomic studies have idenfied ACC subgroups characterized by distinct molecular alterations and associated with different outcomes. A first ACC subgroup is characterized by "C1A" transcriptome profile (proliferation signature), "CIMP" (CpG islands methylator phenotype) methylome profile, "Noisy" chromosome alterations profile (high number of chromosome alterations) and recurrent mutations in p53/Rb and Wnt/ ß-catenin genes. This subgroup is associated with poor prognosis. Conversely, another ACC subgroup is characterized by "C1B" transcriptome profile (immune signature), "non-CIMP" methylome profile, "Chromosomal" (extended loss of heterozygosity) or "Quiet" (limited number of alterations) chromosome alterations profile and low mutational burden. This subgroup is associated with better prognosis. A targeted marker derived from transcriptome - BUB1B-PINK1 expression measured by RT-qPCR - was proposed for ACC prognostication. In line with these previous studies, this thesis aims at developing targeted molecular markers for routine prognostic assessment. First, 4-gene methylation (PAX5, PAX6, PYCARD, GSTP1) measured by MS-MLPA was proposed as a targeted prognostic marker derived from methylome. Then, the molecular classification was summarized using two combinations of targeted molecular markers: 1) a three dimensional (3D)-targeted classifier, based on tumor RNA and DNA, combining BUB1B-PINK1 expression, PAX5-GSTP1-PYCARD-PAX6 methylation, and targeted measurement of chromosome alterations ; 2) a DNA-based targeted classifier, using tumor DNA only, combining PAX5-GSTP1-PYCARD-PAX6 methylation, targeted measurement of chromosome alterations, and somatic mutations of p53/Rb and Wnt/ ß-catenin genes. In localized ACC, combination of tumor stage, tumor-proliferation index, and molecular class provided the most discriminant prognostic model. In a third part, we investigated intratumor heterogeneity of DNA-based prognostic markers. Somatic mutations, and, in a less extent, targeted methylation measurement, could vary from one tumor region to another. Therefore, combination of multiple targeted molecular markers, along with clinical features, should be preferred to gene alterations profile alone for the prognostic assessment of ACC. In the last part, we aimed to determine transcriptome profiles from FFPE samples, using a dedicated protocol of 3' RNA-sequencing. 3' ends are indeed more resistant to paraffin-induced RNA degradation. The 3' RNA-sequencing protocol successfully classified "C1A" and "C1B" transcriptome profiles, and represents a convenient solution for transcriptome-based prognostic classification in FFPE samples. In conclusion, molecular class is established as an essential prognostic factor in localized ACC. Several targeted markers, accounting for the differences in material and techniques availibilty between centers, are proposed for the routine determination of molecular classification. Finally, the determination of transcriptome in FFPE samples paves the way to the integration of genomic medicine into routine care