Ingénierie de senseurs chémogénétiques fluorescents pour la détection et l’imagerie debiomolécules.

La détection optique et la quantification de biomolécules dans des échantillons biologiques nécessitent des systèmes robustes et spécifiques. Les biocapteurs fluorescents génétiquement encodés sont des outils prometteurs, car ils permettent généralement d'obtenir une grande sélectivité pour l'analyte sélectionné. Les biosenseurs sont généralement conçus en couplant un domaine de détection (par exemple un domaine de fixation d'un analyte ou un domaine de substrat enzymatique), capable de subir un important changement conformationnel dépendant d'un signal d'entrée, conjointement avec un module de signalisation fluorescent. Afin d'obtenir des biosenseurs avec un large spectre dynamique, nous proposons d'utiliser le fluorogen activating and absorption-shifting tag (FAST) comme module de signalisation. FAST est un marqueur fluorescent chemo-génétique inductible conçu à partir de la protéine jaune photoactive (photoactive yellow protein, PYP). Ses propriétés fluorescentes proviennent de la fixation réversible et sélective de chromophores fluorogènes. Des biosenseurs pour diverses biomolécules telles que le glutamate, l’ion potassium ou l'adénosine-5'-triphosphate (ATP) ont été générés en couplant des variants de FAST avec différents domaines de détection. Ces développements nous ont permis de coupler la reconnaissance de l'analyte à la fixation du fluorogène, et donc à un changement de fluorescence. Le caractère hybride du module rapporteur a également permis d'obtenir un biosenseur avec une grande modularité, à la fois en termes de propriétés thermodynamiques et optiques. Dans un second temps, diverses permutations circulaires de FAST ont été explorées, et un nouveau site de fragmentation de l’étiquette protéique a été identifié. Cette étude a permis le développement et l'optimisation de nouveaux rapporteurs fluorescents, pouvant être utilisés pour la conception de biosenseurs. De plus, la nouvelle version d'un système splitFAST a permis de visualiser des interactions protéine-protéine avec un très haut contraste.Optical detection and quantification of biomolecules in biological samples require robust and specific systems. In this aim, genetically encoded fluorescent biosensors are promising tools, as they generally provide a high selectivity for the selected analyte. Biosensors are commonly designed by coupling a sensing domain (e.g. analyte-binding domain or enzyme substrate domain), able to undergo a large conformational change upon input signal, together with a fluorescent reporting module. In order to obtain biosensors with high dynamic range, we propose to use fluorogen activating and absorption-shifting tag (FAST) as reporting module. FAST is an inducible chemical-genetic fluorescent marker, that was previously engineered from the photoactive yellow protein (PYP) by directed evolution. Its fluorescent properties arise from the reversible and selective binding of fluorogenic chromophores. High contrast can be achieved, as these so-called fluorogens are dark when free in solution. Biosensors for various analytes, such as glutamate, potassium ion or adenosine-5'-triphosphate (ATP), were generated by conformational coupling of FAST variants with various sensing domains. This design allowed us to condition fluorogen binding, thus fluorescence change, to analyte recognition. The hybrid nature of the reporter unit also provided a large modularity in terms of thermodynamic and optical properties of the biosensors. In a second part, we explored several circular permutations of FAST, and a new splitting site of the tag was identified. This study allowed the development and optimization of new fluorescent reporters, that can be useful in the design of biosensors. Moreover, the newly identified splitFAST system was demonstrated to provide very high imaging contrast for the visualization of protein-protein interactions