Alternative splicing profiling of Aire induced-genes in the thymus

Les cellules médullaires épithéliales thymiques (mTEC), sous l'effet de la protéine Aire sont capables de présenter et d'exprimer un très grand nombre d'autoantigènes tissus-spécifiques (TSAs) aux lymphocytes T en développement pour assurer le processus de sélection négative par délétion clonale des thymocytes qui reconnaissent les peptides auto-antigéniques et la sélection des lymphocytes T régulateurs pour l'établissement et le maintien de la tolérance immunologique. Au vu de l'importance du nombre de TA induits par Aire dans les mTEC et de leur rôle dans l'induction de la tolérance immunologique, nous avons cherché à déterminer si leurs transcrits incluaient, une fois processés, la gamme complète des séquences des événements d'épissage alternatifs (ASE) dont ces gènes peuvent être sujets dans d'autres types cellulaires ou conditions. L'inclusion d'une majorité d'ASE permettrait aux mTEC de présenter une diversité complète de peptides antigéniques du soi aux thymocytes en cours de développement et ainsi promouvrait un processus de sélection des T complet. Bien que deux études (Keane et al 2014, Danan-Gotthold et al 2016), aient permis de montrer que les mTEC présentaient une forte diversité d'isoformes de transcrits de facon général, le niveau de l'épissage et son effet sur l'inclusion d'ASE dans les gènes tissus-spécifiques induits par Aire n'a jamais été étudié. Nous avons alors analysé le ratio d'inclusion de tous les ASE connus chez la souris et avons constaté, avec surprise, une augmentation considérable de la proportion d'ASE exclus des transcrits des gènes induits par Aire par rapport aux autres gènes des mTEC. Nous avons aussi constaté que cette caractéristique spécifique des gènes sensibles à Aire était déjà en place dans les mTECs Aire-KO et était conservée lors de l'induction par Aire. Nous avons également montré que les gènes tissus-spécifiques sensibles à Aire présentent une plus grande proportion d'exclusion d'événements d'épissage alternatif dans les mTEC que dans leurs tissus normaux d'expression, ce qui suggère fortement une perte d'expression de séquences codantes dans les mTEC. Parmi toutes les protéines de liaison à l'ARN exprimées dans les mTEC, nous avons identifié RAVER2 comme le seul facteur d'épissage fortement surexprimé dans ces cellules et étroitement corrélé aux plus faibles niveaux d'activité d'épissage dans les tissus périphériques. RAVER2 est une protéine de liaison au PTB connue pour interagir avec H3K36me3 qui déclenche l'épissage dans certains modèles. L'analyse de données de Chip-seq H3K36me3 dans les mTEC a révélé que les gènes sensibles à Aire sont dépourvus de cette marque et que H3K36me3 est associé à une augmentation de l'épissage alternatif dans les mTEC. L'effet du knockdown, par ARN interférence, de RAVER2 et de ses partenaires sur l'épissage alternatif des transcrits des mTECs primaires devrait permettre d'identifier un rôle direct pour ces molécules. L'hypothèse que nous soutenons est que les gènes sensibles à Aire échappent à l'augmentation de l'inclusion des ASE induite par RAVER2, ce qui suggérerait l'existence d'un trou dans le répertoire des peptides antigéniques des auto-antigènes induits par Aire et présentés par les mTEC aux cellules T en développement.Aire induces medullary epithelial cells (mTECs) to express and present a large number of tissue-restricted self-antigens (TSAs) whose recognition by developing thymocytes triggers immunological tolerance. Although it is well established that mTECs present a high diversity of self-antigen transcript isoforms, the level of splicing and its effect on the inclusion of alternative splicing (AS) events in the TRA genes induced by Aire remain unclear. Therefore, we calculated the ratio of inclusion of all AS events inferred from the mouse mm10 annotated transcripts and found a dramatic increase of the proportion of excluded AS events in Aire- sensitive versus neutral genes in both WT and Aire-KO mTECs. Thus, this specific feature of Aire-sensitive genes is in place in Aire-KO mTECs and conserved upon upregulation by Aire. We also showed that the Aire-sensitive TRA genes present a higher proportion of AS event exclusion in mTECs than in their normal tissues of expression, therefore pointing to a loss of coding sequence expression in mTECs. Among all RNA-binding proteins expressed in mTECs, we identified Raver2 as the only splicing factor significantly upregulated in these cells and tightly correlated with the levels of splicing activity across peripheral tissues. Raver2 is a PTB binding protein known to interact with H3K36me3 that triggers splicing in some models. Analysis of H3K36me3 Chip-seq data in mTECs revealed that the Aire-sensitive genes are deprived of this mark and that H3K36me3 is associated with increased alternative splicing in mTECs. Thus, our results showed that Aire-sensitive genes escape the Raver2-driven enhancement of AS event inclusion occurring at Aire-independent genes in mTECs, suggesting a hole in the repertoire of antigenic peptides of the self-antigens induced by Aire and presented by mTECs to developing thymocytes