Engineering of Spo11 genes to induce targeted meiotic recombinations in the rice genome

La recombinaison méiotique est initiée par la formation programmée de cassures double brin (CDBs) lors de la prophase I de méiose, processus catalysé par un complexe protéique transestérase composé d’un dimère de SPO11. Chez les plantes comme chez la plupart des organismes, les crossing-over (COs) qui sont un résultat de ces CDBs ne sont pas distribués de manière uniforme sur l’ensemble de génome. On observe généralement une diminution des COs au centromère et dans sa périphérie ainsi que dans des régions dont le taux de polymorphisme entre chromosomes homologues est élevé. Chez la levure, il a été démontré qu’il est possible d’induire de la recombinaison ciblée dans le génome à l’aide d’une protéine fusion composée de SPO11 et d’un module de fixation à l’ADN. L’objectif de la thèse a donc consisté dans un premier temps à générer des mutants spo11 dans le riz afin de mieux caractériser ces gènes et dans un second temps d’utiliser une fusion protéique entre une Cas9 inactivée et OsSPO11-1 pour augmenter la recombinaison dans des régions prédéterminées du génome. Chez le riz, contrairement à la levure, 5 gènes OsSPO11 ont été identifiés. D’après les données bibliographiques, les 3 gènes OsSPO11 qui serait impliqués dans le processus méiotique sont OsSPO11-1, OsSPO11-2 et OsSPO11-4. Pour clarifier le rôle de ces trois gènes, nous avons créé des mutants par CRISPR/Cas9. L’ensemble des transformants primaires édités pour les gènes OsSPO11-1 et OsSPO11-2 portaient des mutations bialléliques conduisant à une absence totale de fertilité. Des lignées ségrégeant la mutation ont cependant pu être obtenues soit par complémentation avec un transgène soit par une stratégie de délétion ciblant deux introns, permettant de conserver un des deux allèles muté dans sa séquence mais demeurant fonctionnel. L’analyse cytologique des trois mutants nous amène à penser que le système de CDBs chez le riz est composé du même complexe protéique que chez Arabidopsis (SPO11-1+SPO11-2+MTOPVIB) et que OsSPO11-4 n’a pas de rôle majeur dans le processus de recombinaison méiotique. Dans la deuxième partie nous avons introduit une fusion dCas9::SPO11-1 chez le cv. Kitaake et un construit portant les sgRNAs permettant le ciblage chez le cv. Kalinga III. La caractérisation moléculaire des lignées a permis de sélectionner les meilleures plantes à croiser pour obtenir des plantes hybrides chez lesquelles les deux transgènes seront exprimés lors de la méiose. L’analyse des descendances F2 de ces hybrides a montré sur une première région que la recombinaison n’avait pas été modifiée alors que sur une seconde région, nous avons pu observer 5 recombinants supplémentaires (10 vs 5). De plus les 5 recombinants sont tous localisés sur un intervalle de ~1kb situé dans la région promotrice du gène le plus proche des cibles. Ce résultat suggère que notre construction peut induire de la recombinaison ciblée mais d’autres expériences seront néanmoins nécessaires pour consolider ce résultat.Meiotic recombination is initiated by the programmed induction of chromosomal DNA double-strand breaks (DSBs) catalyzed by the transesterase SPO11 complex during the prophase of meiosis I. In plants, as in most organisms, meiotic crossovers are not evenly distributed along the chromosomes: reduced recombination is generally observed in centromeres and peri-centromeres as well as in regions exhibiting high polymorphism/structural heterology between homologous chromosomes. In yeast, fusion proteins between SPO11 and various DNA binding modules are able to induce targeted DSBs and recombination. The goal of this thesis was first to better characterize the OsSPO11 rice genes by generating spo11 mutants and, second, to engineer in rice a fusion protein between an inactivated Cas9 and OsSPO11-1 to induce a targeted recombination. Contrasting with yeast, 5 OsSPO11 genes have been identified in rice. According to the literature, OsSPO11 genes with putative meiotic function are OsSPO11-1, OsSPO11-2 and OsSPO11-4. To clarify the role of these three genes, CRISPR/Cas9 mutants were generated. We obtained only biallelic mutations in primary transformants edited in either OsSPO11-1 or OsSPO11-2 conducting to a complete absence of fertility. Lines segregating mutations have been obtained either by complementation with a transgene or through a dual intron targeted deletion strategy allowing to keep one of the two alleles mutated but still functional. Cytological analyzes of the 3 mutants indicate that the active catalytic complex in rice is similar to the Arabidopsis complex (SPO11-1-SPO11-2+MTOPVIB) and that OsSPO11-4 has no major role in meiotic recombination. In the second part of the thesis, we introduced separately a dCas9::SPO11-1 fusion and a construct carrying sgRNAs, allowing to target specific regions of the rice genome, in cv. Kitaake and Kalinga III respectively. Transformed plants have been characterized and selected for crossing to generate F1 hybrid plants expressing both transgenes during meiosis. Genotyping of F2 populations showed no increase in recombination in the first targeted region but reveals 5 additional recombinants in the second targeted region (10 vs 5). Interestingly these 5 recombinants were all localized in the same ~1kb interval in the promoter region of the gene closest to the target. These results suggest that our construct is able to induce targeted recombination but other experiments will be necessary to consolidate these findings