Study of the natural cactus extracts protective effects on oxidative stress and inflammation related to peroxisomal β-oxidation deficiencies

L’objectif de mes travaux de thèse était de mieux comprendre le rôle des cellules microgliales dans la neuroinflammation initiée dans plusieurs leucodystrophies peroxysomales neurovégétatives et d’explorer les effets protecteurs de substances issues du cactus Opuntia ficus indica. Pour ce faire, nous avons utilisé comme modèle in vitro des cellules microgliales déficientes en transporteurs ATP Binding Cassette D (ABCD1 et ABCD2) ou en acyl-CoA oxydase 1 (ACOX1). Il s’agit de deux lignées cellulaires murines BV-2, déficiente en Abcd1/Abcd2 - /- ou déficiente en Acox1-/-, obtenues par ailleurs par édition génique grâce à la méthodologie CRISPR/Cas9. Nos résultats ont permis : (i) de caractériser, par analyse en centrifugation différentielle et ultracentrifugation isopycnique, l’impact de ces déficiences (Acox1 -/- ou Abcd1/d2-/-) sur la taille et /ou la densité des peroxysomes et les autres organites cellulaires grâce aux activités des enzymes marqueurs. De plus, nous avons démontré une modification de la capacité phagocytaire de ces cellules microgliales mutantes ; (ii) d’explorer l’effet protecteur de l’huile de graines de cactus (CSO), Opuntia ficus-indica, in vivo chez les souris, traitées ou non par des lipopolysaccharides (LPS), montrant ainsi une activité anti-inflammatoire de la CSO en réduisant aussi bien au niveau cérébrale l’expression d’iNos qu’au niveau hépatique les expressions de l’Il- 1β et l’Il-6. La CSO est capable également de rétablir les activités peroxysomales respectivement, antioxydante de la catalase et -oxydative de l’ACOX1 affectées par le traitement aux LPS ; (iii) d’évaluer, dans les cellules sauvages et déficientes en Acox1, le potentiel protecteur de deux familles de substances issues de cactus (flavanols :isorhamnétine, isorhamnétine-rutinoside, quercétine ; et polyphénols : férulaldéhyde, syringaldéhyde, vanilline) contre l’inflammation et le stress oxydatif générés par l’absence de l’activité ACOX1 et/ou par les LPS. Ces substances issues de cactus sont capables de réduire l’expression des médiateurs pro-inflammatoires (TNFα, NLRP3, IL-1β) et la production de NO, d’augmenter l’expression des enzymes antioxydantes peroxysomales (Catalase et SOD1), et de restaurer les fonctions lysosomales impactées par le stress cellulaire induit par l’absence de l’activité ACOX1 ou par le traitement aux LPS.The objective of my thesis work was to better understand the role of microglial cells in neuroinflammation initiated in several neurovegetative peroxisomal leukodystrophies and to explore the protective effects of substances from the cactus Opuntia ficus indica. To this end, we used as an in vitro model microglial cells deficient in ATP Binding Cassette D transporters (ABCD 1 and ABCD 2) or acyl-CoA oxidase 1 (ACOX1). These are two BV-2 murine cell lines, deficient in Abcd1/Abcd2-/- or deficient in Acox1-/-, obtained elsewhere by gene editing using the CRISPR/Cas9 methodology. Our results made it possible to: (i) characterize, by differential centrifugation and isopycnic ultracentrifugation analysis, the impact of these deficiencies (Acox1- /- or Abcd1/d2-/-) on the size and/or the density of peroxisomes and other cellular organelles thanks to the activities of marker enzymes. We also revealed a change in the phagocytic capacity of these mutant microglial cells; (ii) to explore the protective effect of cactus seed oil (CSO), Opuntia ficus-indica, in vivo in mice, treated or not with lipopolysaccharides (LPS), thus showing anti-inflammatory activity of CSO by reducing both cerebral expression of iNos and at the hepatic level the expressions of Il-1β and Il-6. CSO was also able to restore peroxisomal activities, antioxidant of catalase and -oxidative of ACOX1, respectively affected by LPS treatment; (iii) to evaluate, in wild and deficient in Acox1 cells, the protective potential of two families of cactus substances (flavanols: isorhamnetin, isorhamnetin-rutinoside, quercetin; and polyphenols: ferulaldehyde, syringaldehyde, vanillin) against inflammation and oxidative stress generated by the absence of ACOX1 activity and/or LPS treatment. These cactus-derived substances can reduce the expression of pro-inflammatory mediators (TNFα, NLRP3, IL-1β) and the production of NO, increase the expression of peroxisomal antioxidant enzymes (Catalase and SOD1), and restore the lysosomal functions impacted by cellular stress induced by the absence of ACOX1 activity or by LPS treatment