Combinaison des technologies de vecteur lentiviral et d'édition du génome pour le traitement des bêta-hémoglobinopathies

La drépanocytose et la bêta-thalassémie sont causées par des mutations affectant le gène de la globine-bêta (HBB). Dans la drépanocytose, la substitution d'un acide aminé dans la chaîne bêta entraine la polymérisation de l'hémoglobine drépanocytaire (HbS) provoquant la déformation des globules rouges (GR). La bêta-thalassémie est causée par des mutations entrainant la réduction, voire l'absence, de synthèse des chaines de globine bêta, provoquant la mort prématurée des précurseurs érythroïdes ainsi qu'une production insuffisante d'hémoglobine dans les GR. Les niveaux élevés d'hémoglobine fœtale (HbF) améliorent les symptômes des patients drépanocytaires et bêta-thalassémiques. Cependant, les traitements pharmacologiques induisant l'expression d'HbF ne sont pas efficaces chez tous les patients. La transplantation allogénique de cellules souches/progénitrices (CSP) est le seul traitement curatif actuel, toutefois, il n'est accessible que pour une minorité des patients. La transplantation autologue de CSP transduites à l'aide d'un vecteur lentiviral (LV) exprimant une globine thérapeutique (bêta-AS3) est une stratégie alternative pour le traitement des hémoglobinopathies bêta. Néanmoins, la correction du phénotype pathologique requiert une forte expression de l'hémoglobine thérapeutique, nécessitant une grande quantité de copies de vecteur par cellule (VCN). Nous avons développé une nouvelle approche thérapeutique basée sur l'utilisation combinée d'un LV exprimant la bêta-AS3 (LV.AS3mod) et la technologie CRISPR/Cas9. La nucléase Cas9 permet soit de cibler le gène de la globine-bêta muté (pour la drépanocytose) ou d'autres régions génomiques induisant la réactivation de l'HbF (pour la drépanocytose et la bêta-thalassémie). Pour cela, nous avons transduit des lignées cellulaires erythroïdes ainsi que des CSP de patients avec le LV.AS3mod contenant un ARN guide (gRNA) ciblant (i) le gène de la globine bêta muté (LV.AS3mod.gR-D), (ii) l'enhancer érythroïde de BCL11A : répresseur de la globine-gamma (LV.AS3mod.gR-BCL11A), ou (iii) un site d'hybridation de BCL11A situé au niveau des promoteurs des gènes de la globine-gamma (LV.AS3mod.gR-13bpdel). L'ajout d'un gRNA dans le LV.AS3mod n'a pas réduit son titre ou sa capacité d'infection. Une forte diminution de la globine bêta et une augmentation de l'incorporation de la globine bêta-AS3 dans les tétramères d'hémoglobine (HbAS3) ont été observées dans les cellules traitées avec le LV.AS3mod.gR-D. De plus, un faible VCN nous a permis de mesurer une quantité équivalente d'HbS et d'HbAS3 dans les GR différenciés ex vivo, reproduisant le profil des porteurs hétérozygotes asymptomatiques. Les traitements LV.AS3mod.gR-13bpdel et LV.AS3mod.gR-BCL11A ont entrainé une réactivation de la globine-gamma, avec une efficacité plus importante pour la condition LV.AS3mod.gR-13bpdel, entrainant une expression abondante d'HbAS3 et d'HbF associée à une diminution de l'expression d'HbS. La proportion de GR falciforme est d'autant plus réduite après administration de notre stratégie combinée, démontrant son avantage par rapport aux stratégies classiques d'intégration d'un transgène thérapeutique. Les gRNAs utilisés ont montré une très faible activité hors cible dans les cellules primaires des patients. En parallèle nous avons utilisé la technologie de microscopie quantitative de phase pour développer un outil d'évaluation des paramètres des GR de patients drépanocytaires, beta-thalassémiques ainsi que ceux générés in vitro. Nous avons mesuré les paramètres dans chaque GR, démontrant que notre stratégie n'altère pas la différentiation érythroïde et mène à une expression d'hémoglobine thérapeutique fonctionnelle. Ces résultats ont démontré que notre stratégie est sûre et plus efficace que les approches de thérapies géniques actuelles pour le traitement de la drépanocytose et de la bêta-thalassémie, en évitant la potentielle genotoxicité associée aux VCN élevés requis pour aboutir à un effet thérapeutique.Sickle cell disease (SCD) and beta-thalassemia are the most common monogenic disorders worldwide and are caused by mutations affecting the beta-globin (HBB) gene expression. In SCD an amino acid substitution in the beta-globin chain leads to polymerization of the sickle hemoglobin (HbS) and deformation of red blood cells (RBCs). In beta-thalassemia, the reduced synthesis of beta-globin chains causes death of RBC precursors and the production of insufficiently hemoglobinized RBCs. Elevated levels of fetal gamma-globin chains ameliorate the clinical phenotype of both SCD and beta-thalassemia patients. However, pharmacological gamma-globin inducers are not effective in all the patients. Transplantation of allogeneic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) is the only definitive therapy but is limited by the lack of compatible donors. Autologous transplantation of HSPCs transduced with a lentiviral vector (LV) expressing an anti-sickling HBB variant (e.g., betaAS3) is a potential treatment for SCD and beta-thalassemia patients but requires high levels of Hb tetramers (e.g., HbAS3) containing the transgene-derived globin (i.e., a high vector copy number [VCN]) to fully correct the pathological phenotype. In this study, we developed a therapeutic approach for SCD and beta-thalassemia combining a LV-based gene addition strategy with CRISPR/Cas9-mediated knock-down of the sickle beta-globin (for SCD) or reactivation of the endogenous fetal gamma-globin (for both SCD and beta-thalassemia). We transduced erythroid cell lines and patient HSPCs with LVs expressing the anti-sickling ßAS3 transgene and a guide RNA (gRNA) targeting: (i) the sickle HBB gene (LV.AS3mod.gR-D), (ii) the erythroid specific enhancer of the HbF repressor BCL11A (LV.AS3mod.gR-BCL11A), or (iii) the BCL11A binding site within the gamma-globin promoters (LV.AS3mod.gR-13bpdel). Importantly, the addition of the gRNA expression cassette in the betaAS3-expressing LV did not reduce vector titer and infectivity. LV.AS3mod.gR-D caused beta-globin knock-down and an increased incorporation of betaAS3 within the Hb tetramers. Noteworthy, an equal amount of HbS and HbAS3 tetramers (resembling the Hb profile of asymptomatic heterozygous carriers) was achieved with a low VCN in RBCs derived from LV.AS3mod.gR-D-treated SCD HSPCs. LV.AS3mod.gR-13bpdel and LV.AS3mod.gR-BCL11A led to gamma-globin reactivation, which was more robust in LV.AS3mod.gR-13bpdel-treated samples resulting in a high proportion of Hb tetramers containing the therapeutic betaAS3- and gamma-globins and a concomitant decrease of the HbS expression. Notably, we demonstrated a more robust reduction in RBC sickling using our combined strategies compared to classical gene addition approach. Finally, we detected minimal off-target editing activity in patient-derived primary cells. In parallel, we exploited a quantitative phase microscopy technology to develop a tool that evaluates RBC parameters in the blood of SCD and beta-thalassemia patients and in in vitro cultured cells. We measured RBC parameters (e.g., Hb amount, size, shape) at single-cell level and showed that the treatment of patient HSPCs with our combined strategy does not impair erythroid maturation and leads to therapeutically relevant Hb expression. Altogether, these results demonstrate that our strategy is safe and more efficacious compared to the current gene therapy approach for SCD and beta-thalassemia, avoiding the potential genotoxicity associated with high VCN and reducing the amount of vector required to achieve a therapeutic effect