Biologie structurale intégrative d'un supercomplexe métabolique PDH/ODH de Corynebacterium glutamicum

Cette thèse de doctorat fait partie d'un projet plus large qui vise à décortiquer la plasticité métabolique des Actinobactéries, un phylum de plus importants parmi les procaryotes et qui inclut des pathogènes importants comme Mycobacterium tuberculosis, en même temps que des espèces d'intérêt industriel comme Corynebacterium glutamicum. Le projet examine la régulation des noeuds du pyruvate et de l'oxoglutarate, au croisement du métabolisme du carbone et de l'azote, et utilise C. glutamicum comme modèle de travail. Mon travail de thèse a été focalisé sur la caractérisation structurale et biochimique d'un supercomplexe mixte incluant la pyruvate déshydrogénase (PDH) et la 2-oxoglutarate déshydrogénase (ODH), initialement identifié chez C. glutamicum. Une approche de biologie structurale intégrative a donc été suivie afin de disséquer la structure tridimensionnelle des protéines dans ce supercomplexe, comment elles interagissent et sont régulées. La première partie de cette thèse est consacrée à l'étude structurale de la 2-oxoglutarate déshydrogénase OdhA, un grand enzyme de plus de 1200 résidus issu de la fusion de deux domaines, normalement localisés sur des enzymes séparés, chacun apportant une activité distincte. La structure, résolue par analyse des particules isolées par cryo-microscopie électronique (cryo-ME) et par cristallographie aux rayons X, montre que l'enzyme est structuré comme un trimère de dimères, une architecture homohéxamérique jusqu'à présent jamais observée pour cette famille d'enzymes. Différents complexes d'OdhA, avec substrats ou régulateurs allostériques, ont été résolus par analyse des particules isolées par cryo-ME, tous à des résolutions entre 2.2 et 2.3 Å, permettant de montrer qu'OdhA passe par un changement conformationnel pour aller d'un état de repos à un état activé. J'ai pu aussi montrer, par une structure cryo-ME à haute résolution du complexe OdhA-OdhI, qu'OdhI, une petite protéine à domaine FHA, agit en tant qu'inhibiteur allostérique de OdhA en empêchant ce changement conformationnel. Ces résultats sont en accord avec les travaux antérieurs du laboratoire sur les protéines correspondantes de Mycobacterium smegmatis, une espèce modèle pour M. tuberculosis. La deuxième partie de ma thèse est consacrée à l'analyse des interactions protéine-protéines au sein du supercomplexe. Pour cela, en collaboration avec la Plateforme de Biophysique Moléculaire de l'Institut Pasteur, j'ai utilisé nombre de techniques biophysiques, de la résonance plasmonique de surface (SPR) à la photométrie de masse, à l'ultracentrifugation analytique et la diffusion de lumière multi-angle couplée à la chromatographie par exclusion stérique (SEC-MALLS). Les résultats nous fournissent une vue d'ensemble des interactions protéine-protéine principales à l'intérieur du supercomplexe PDH/ODH. En outre, j'ai obtenu deux structures cristallographiques de composants du supercomplexe associés à des peptides de leur partenaires d'interactions, c'est à dire la structure cristallographique du cœur trimerique de AceF (dihydrolipoyl acetyltransférase) en complexe avec le peptide N-terminale de OdhA, et la structure cristallographique de la Lpd (dihydrolipoyl déshydrogénase) en complexe avec le domaine périphérique de liaison aux sous-unités (PSBD) de AceF. La dernière partie de cette thèse décrit la coexpression et purification chez Escherichia coli des quatre composants du supercomplexe PDH/ODH de C. glutamicum, et la caractérisation préliminaire du complexe purifié. Je conclue en discutant les implications de notre travail pour la compréhension de la régulation du métabolisme central chez les Actinobactéries, comment nos résultats défient des vieux 'dogmes' et posent une nouvelle lumière sur l'évolution de complexes du type 2-oxoacides déshydrogénase, et les perspectives du projet et du domaine.This PhD thesis is part of a larger project that aims at dissecting the metabolic plasticity of Actinobacteria, one of the largest prokaryotic phyla that includes important human pathogens like Mycobacterium tuberculosis, as well as species of industrial interest like Corynebacterium glutamicum. The project looks at the regulation of the pyruvate and oxoglutarate metabolic nodes, at the crossroad of carbon and nitrogen metabolism, and uses C. glutamicum as the working model. My PhD work has been focused on the structural and biochemical characterization of a mixed supercomplex embedding both the pyruvate dehydrogenase (PDH) and 2-oxoglutarate dehydrogenase (ODH) complexes, which was first identified in C. glutamicum. An integrated structural biology approach was therefore followed to untangle the three-dimensional architecture of proteins in this supercomplex, how they interact each other and how they are regulated. The first part of the PhD thesis is dedicated to the structural study of the 2-oxoglutarate dehydrogenase OdhA, a large enzyme of more than 1200 residues resulting from the fusion of two domains, normally localized on separate enzymes, each bearing a distinct activity. The structure, solved both by single particle cryo-EM and X-ray crystallography, shows that the enzyme is structured as a trimer of dimers, an homohexameric architecture never observed so far for this family of enzymes. Several complexes of OdhA, either with substrates or allosteric regulators, were solved by single particle cryo-EM, all at resolutions between 2.2 and 2.3 Å, allowing to show that OdhA undergoes a conformational switch from a resting to an activated state. I could also show, through a high-resolution cryo-EM structure of the OdhA-OdhI complex, that OdhI, a small FHA domain protein, acts as an allosteric inhibitor on OdhA by hindering this conformational change. These results are fully consistent with previous work in the lab made on the corresponding proteins from Mycobacterium smegmatis, a model species for M. tuberculosis. The second part of my PhD thesis is dedicated to the analysis of protein-protein interactions within the supercomplex. To do so, in collaboration with the Molecular Biophysics Platform at the Institut Pasteur, I applied a number of biophysical techniques, ranging from surface plasmon resonance (SPR) and mass photometry to analytical ultracentrifugation and multiangle light scattering coupled to size exclusion chromatography (SEC-MALLS). The results provide us with an overall view of major protein-protein interactions with the PDH/ODH supercomplex. In addition, I obtained two crystal structures of supercomplex components associated to peptides from their interacting partners, i.e. the crystal structure of the trimeric AceF (dihydrolipoyl acetyltransferase) core in complex with the N-terminal peptide from OdhA, as well as the crystal structure of Lpd (dihydrolypoyl dehydrogenase) in complex with the peripheral subunit binding domain (PSBD) from AceF. The last part of this PhD thesis describes the coexpression and purification in Escherichia coli of the four PDH/ODH supercomplex components from C. glutamicum, and the preliminary characterization of the purified complex. I then conclude discussing the implications of our work for the understanding of the regulation of central metabolism in Actinobacteria, how our results challenge old 'dogmas' and shed new light on the evolution of 2-oxoacid dehydrogenase complexes, and discuss perspectives of the project and the field