Développement d'un microsystème d'analyse de micro-tissus par spectroscopie diélectrique hyperfréquence pour l'évaluation en temps réel d'effets biologiques d'agents chimiques

National audienceMicrowave dielectric spectroscopy is a promising analytical technique for many fields of application, especially cell biology. It allows to study cells in their culture medium in a non-invasive and non-destructive way thanks to their dielectric properties. This can be done at various scales, from organ or tissue, from cell suspensions to single cell analysis. In addition, there is an intermediate scale not yet approached with such an analysis technique, that of micro-tissues or spheroids, a highly prized in vitro biological model because it is close to the problems encountered in vivo. These are clusters of cells aggregated together, which present different gradients, both in composition and environment. The cells are in contact with each other and form a sphere, hence the term 3D model or spheroid. The aim of this thesis is to extend the capabilities of cellular analysis by dielectric microwave spectroscopy to this new scale, that of micro-tissues. This work follows a first demonstrator previously developed in the MH2F research team of LAAS. This first Radiofrequency (RF) microsensor adapted to the microwave measurement of spheroids of 300 µm diameter maintained in their culture medium by an open fluidic system of the reservoir type had been designed, manufactured and started to be evaluated beforehand. In addition to further characterization of this component using multiple models, polystyrene beads and spheroids, to define its measurement capabilities and limitations, an electrical model to obtain the dielectric parameters of the object under study was developed. Thus, after having introduced the spheroids as a biological model and the various existing characterization techniques of this type of model in a first chapter, the second chapter is dedicated to the introduction of this first demonstrator and its analysis capacities. Different solutions were then considered in order to overcome these limitations, including making the fluidic configuration closed in association with a blocking system of the spheroid to be studied for a precise positioning and thus increase the detection sensitivity. The third chapter of this manuscript presents the corresponding developments, namely the completely redesigned component and the optimization of its manufacturing process. A study of the detection sensitivity according to the dimensioning of the sensor has also been carried out numerically and verified experimentally. The characterization of living spheroids, fixed and also subjected to another chemical agent than paraformaldehyde (used for fixation), chloroquine, allowed to evaluate the potential of the device for a drug screening application. To carry out this study, a collaboration with the company Anti-Oxidant Power was conducted. The detection by RF technique of the impact of the cellular environmental change on spheroids for different concentrations of applied chemical agent thus gives an important proof of concept at the scale of 3D model of the adequacy of this measurement technique to observe cellular and even tissue transformations, in complementarity with the traditional optical tools, and this in a non-invasive and non-destructive way and without need for preliminary marking. These results open new analytical perspectives to evaluate the biological response of such 3D models submitted to chemical agents.La spectroscopie diélectrique micro-onde représente une technique analytique prometteuse pour de nombreux champs applicatifs, biologie cellulaire notamment. Elle permet en effet d'étudier de façon non invasive et non destructive des cellules dans leur milieu de culture grâce à leurs propriétés diélectriques. Ceci peut être réalisé à des échelles variées, que ce soit à l'échelle de l'organe ou du tissu, de suspensions de cellules jusqu'à l'analyse de cellules individuelles. En outre, il existe une échelle intermédiaire non encore abordée avec une telle technique d'analyse, celle des micro-tissus ou encore appelés sphéroïdes, modèle biologique in vitro fortement prisé car se rapprochant des problématiques rencontrées in vivo. Il s'agit d'amas de cellules agrégées entre elles, qui présentent différents gradients, tant en composition qu'environnemental. Les cellules sont en contact les unes aux autres et forment une sphère, d'où le terme de modèle 3D ou encore de sphéroïde. Les travaux de thèse visent donc à étendre les capacités d'analyse cellulaire par spectroscopie diélectrique micro-onde à cette nouvelle échelle, celle des micro-tissus. Les travaux réalisés font suite à un premier démonstrateur développé antérieurement dans l'équipe de recherche MH2F du LAAS. Ce premier micro-capteur RadioFréquence (RF) adapté à la mesure micro-onde de sphéroïdes de 300 µm de diamètre maintenu dans leur milieu de culture par un système fluidique ouvert de type réservoir avait été conçu, fabriqué et commencé à être évalué au préalable. Outre une caractérisation plus poussée de ce composant à l'aide de multiples modèles, billes de polystyrène et sphéroïdes, pour en définir les capacités et limitations de mesure, une modélisation électrique permettant d'obtenir les paramètres diélectriques de l'objet étudié a ainsi été développée. Ainsi, après avoir introduit les sphéroïdes comme modèle biologique et les différentes techniques de caractérisation existantes de ce type de modèle dans un premier chapitre, le second chapitre est dédié à l'introduction de ce premier démonstrateur et de ses capacités d'analyse. Différentes solutions ont alors été envisagées afin de pallier ces limitations, dont le fait de rendre la configuration fluidique fermée en association à un système de blocage du sphéroïde à étudier pour un positionnement précis et donc augmenter la sensibilité de détection. Le troisième chapitre de ce manuscrit présente les développements correspondants, à savoir la conception totalement revue du composant et l'optimisation de son procédé de fabrication. Une étude de sensibilité de détection suivant le dimensionnement du capteur a également été menée numériquement et vérifiée expérimentalement. La caractérisation de sphéroïdes vivants, fixés et aussi soumis à un autre agent chimique que le paraformaldéhyde (utilisé pour la fixation), la chloroquine, a permis d'évaluer le potentiel du dispositif en vue d'une application de type criblage de médicaments. Pour réaliser cette étude, une collaboration avec l'entreprise Anti-Oxydant Power a été menée. La détection par technique RF de l'impact du changement environnemental cellulaire sur sphéroïdes pour différentes concentrations d'agent chimique appliqué donne ainsi une preuve de concept importante à l'échelle de modèle 3D de l'adéquation de cette technique de mesure pour observer des transformations cellulaires et même tissulaires, en complémentarité aux outils optiques classiques, et ce de façon non invasive et non destructive et sans besoin de marquage préalable. Ces résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives d'analyse pour évaluer la réponse biologique de tels modèles tridimensionnels soumis à des agents chimiques