Caractérisation biochimique des protéines REC114, MEI4 et IHO1 impliquées dans l’initiation de la recombinaison méiotique chez la souris

Meiosis is a specialized cell division program that allows the formation of haploid gametes from diploid cells in sexually reproducing organisms. The halving of this genetic content is a result of the cell division process where only one round of DNA replication is followed by two divisions (Meiosis I and Meiosis II). Chromosome reduction occurs during meiosis I where maternal and paternal homologous chromosomes are separated. This process involves the formation of DNA double-strand breaks that are repaired by homologous recombination, also called meiotic recombination. This mechanism allows the formation of physical links, the crossing-overs (CO), between homologues through reciprocal exchanges. The formation of at least one CO per homologue pair, called obligatory CO, is required for faithful meiotic recombination. As such, meiosis generates genetic diversity in a population; however, meiotic errors are also the major causes of aneuploidy, congenital anomalies and infertility.DSB formation is catalyzed by the SPO11-TOPOVIBL complex and a set of partially conserved DSB formation-regulating proteins. In mammals, there are at least seven proteins that are essential for DSB formation: REC114, MEI4, IHO1, HORMAD1/2, MEI1, ANKRD31, but the exact role of these proteins and the molecular mechanism of their action remain unclear. My work focused on REC114, MEI4, and IHO1 proteins. The aim of my thesis was to perform a biophysical and structural analysis of these protein factors and characterize the molecular details of their interactions.Constructs of IHO1 and the REC114-MEI4 sub-complex were produced in bacteria and then purified separately. Protein samples were characterized by several techniques (SEC-MALS, mass spectrometry and AUC) to determine their oligomeric states. The different analyses established that the IHO1 protein was tetrameric while the REC114-MEI4 sub-complex is present mainly in heterotrimeric form (2REC114/1MEI4). During this thesis, the interaction between the REC114-MEI4 sub-complex and the IHO1 protein was initially identified by size exclusion chromatography and then confirmed by ITC analyses. This work revealed the role of the N-terminal part of IHO1 and the PH domain of REC114 in this interaction. The structural characterization of the REC114-MEI4 complex and of the IHO1 protein alone or in a complex with REC114 was initiated by several techniques combining crystallography, nuclear magnetic resonance and electronic microscopy but still requires optimizations. Nevertheless, the modelling of the three-dimensional structure of the proteins by AlphaFold2 allowed us to obtain structural insight into the dimerization of REC114 and its interactions with MEI4 and IHOI. I identified residues involved in these interactions and their mutagenesis was used to validate the structural models in vitro. The in vivo characterization of the effect of these mutations is been performed in collaboration with the team of Dr. Bernard De Massy (IGH Montpellier). The results obtained during this work will be followed up with further structural and functional studies on these meiotic proteins, either alone or in the presence of additional partners.La méiose est une division cellulaire spécialisée des cellules germinales qui permet la production des gamètes haploïdes en réduisant de moitié le nombre de chromosomes des cellules mères. Ce processus est constitué d’un cycle de réplication suivi de deux cycles de division : méiose I et méiose II. La réduction des chromosomes a lieu pendant la méiose I où les chromosomes homologues d’origine maternelle et paternelle sont séparés. Cette ségrégation réductionnelle nécessite la formation de plusieurs cassures double-brin de l'ADN (DSB) et leur réparation par la recombinaison homologue, appelée également recombinaison méiotique. Ce mécanisme permet la création de liens physiques entre les chromosomes via des échanges réciproques d’informations génétiques entre les homologues, ou crossing-over (CO). La formation d'au moins un CO, dit obligatoire, entre chaque paire d'homologues est requise pour une ségrégation réductionnelle appropriée. De plus, ce brassage génétique permet de générer des diversités génétiques au sein des populations. Cependant, les erreurs de la méiose sont les principales causes d'aneuploïdie, de malformations congénitales et d’infertilité.Lors de la recombinaison méiotique, la formation des DSB est catalysée par un complexe du type topoisomérase, composé de l'enzyme SPO11 et de son partenaire de liaison TOPOVIBL. Toutefois, l’activité de ce complexe nécessite un ensemble partiellement conservé de protéines régulatrices, qui sont sept chez les mammifères : REC114, MEI4, IHO1, HORMAD1/2, MEI1, ANKRD31. Malgré leurs importances lors de la formation des DSB, le rôle exact de ces protéines et le mécanisme moléculaire de leurs actions ne sont pas bien caractérisés. Mon travail s’est porté sur les protéines REC114, MEI4, et IHO1. Le but de mon projet de thèse était de réaliser une étude biophysique et structurale de ces facteurs protéiques afin de comprendre leurs organisations et de caractériser les détails moléculaires de leurs interactions.Les constructions protéiques d’IHO1 et du sous-complexe REC114-MEI4 ont été produites en bactérie puis purifiées séparément. Les échantillons protéiques ont été caractérisés par plusieurs techniques (SEC-MALS, spectrométrie de masse et AUC) pour déterminer leurs états oligomériques. Les différentes analyses ont établi que la protéine IHO1 est tétramérique alors que le sous-complexe REC114-MEI4 est présent principalement sous forme hétérotrimérique en solution (2REC114/1MEI4). Durant cette thèse, l’interaction entre le sous-complexe REC114-MEI4 et la protéine IHO1 a été identifiée initialement par la chromatographie d’exclusion de taille, puis elle a été confirmée et son affinité a été caractérisée par des analyses ITC. Ce travail a permis de mettre en évidence le rôle de la partie N-terminale d’IHO1 et du domaine PH de REC114 pour cette interaction. La caractérisation structurale du complexe REC114-MEI4 et de la protéine IHO1 seule ou en complexe a été initiée par plusieurs techniques combinant la cristallographie, la résonance magnétique nucléaire et microscopie électronique. Actuellement, des cristaux sont obtenus et sont en cours d’optimisation pour le fragment structuré d’IHO1, tandis que la caractérisation du complexe REC114-MEI4 par RMN et du complexe REC114-IHO1-MEI4 par la microscopie électronique nécessite encore des optimisations. Par ailleurs, la modélisation de la structure tridimensionnelle des protéines par AlphaFold2 nous a permis d’identifier les résidus impliqués dans la dimérisation de REC114 et dans son interaction avec MEI4 et IHO1. Ceux-ci ont été mutés et analysés in vitro. Un projet de test in vivo de l’effet de ces mutations est en cours en collaboration avec l’équipe du Dr. Bernard De Massy (IGH Montpelier). Les résultats obtenus durant ce travail seront poursuivis par des études structurales et fonctionnelles plus approfondies sur ces protéines méiotiques, seules ou en présence de partenaires supplémentaires