Herstellung und Charakterisierung von rekombinanten, ETA-basierten CD64-Immuntoxinen zur Bekämpfung von dysregulierten Makrophagen bei chronischen Hautentzündungen

Dysregulierte, aktivierte Makrophagen spielen bei verschiedenen chronisch entzündlichen kutanen Erkrankungen eine entscheidende Rolle. Die Tatsache, dass nach selektiver Eliminierung der CD64 überexprimierenden Makrophagen, durch CD64 Immuntoxine (Volllängenantikörper mit einem Toxin), es zu einer Auflösung von chronischen Entzündungen kommt, bestätigt dies. Die Immuntoxine aus erster Generation können jedoch nicht in homogener Qualität hergestellt und ihre biologischen und physikochemischen Eigenschaften kaum optimiert werden. Ziel der vorliegenden Dissertationsarbeit war es deshalb, rekombinante ETA´-basierte single-chain-Fragmente gegen das Zielmolekül CD64 herzustellen und als mögliche Therapieform bei chronischen (Haut)-Entzündungen zu überprüfen. Sowohl das monovalente H22(scFv)-ETA´ als auch das bivalente H22(scFv)2-ETA´ Immuntoxin sollten in E. coli hergestellt, aufgereinigt und die biologischen Eigenschaften sowohl in-vitro als auch im Tiermodell charakterisiert werden. Der Focus lag dabei auf dem Vergleich des monovalenten mit dem bivalenten Immuntoxin in-vitro und in-vivo. Das bivalente Immuntoxin sollte über seine CD64 quervernetzende Eigenschaft deutlich besser von den dysregulierten Makrophagen aufgenommen werden als das monovalente Immuntoxin und damit auch eine verbesserte spezifische Zytotoxizität entwickeln. Die Immuntoxine wurden nach Fermentation erfolgreich durch die Kombination von verschiedenen chromatographischen Verfahren wie IMAC, SEC und HAPC aus dem E. coli Periplasma gereinigt. Die HAPC entfernte idealerweise nicht nur effektiv bakterielle Endotoxine (kleiner-gleich 0,5 EU/ml), sondern war auch in der Lage Degradationsprodukte der beiden Immuntoxine stark abzureichern. Im Zuge dieser Arbeit wurden erfolgreich Fermentations-, Reinigungs- und Lagerungsprotokolle etabliert, mit denen es möglich wurde hohe Mengen an Immuntoxinen für die Analysen über einen längeren Zeitraum ohne Aktivitätsverlust zur Verfügung zu stellen. Die produzierten Mengen an Immuntoxin lagen nach Reinigung für H22(scFv)-ETA´ bei 2 mg/L und für H22(scFv)2-ETA´ bei 0,5 mg/L. Die spezifische Bindung der gereinigten Immuntoxine konnte mittels Durchflusszytometrie und ELISA eindeutig bestätigt werden. In-vitro wurde außerdem eine rezeptorvermittelte Endozytose mittels Konfokalmikroskopie visualisiert, die im Zytotoxizitätstest eindeutig zu einer spezifischen konzentrationsabhängigen Abtötung der monozytären U937 Zellen führte. Der ermittelte IC50-Wert des bivalenten Konstruktes erwies sich als 10-fach niedriger (14 pM) als der IC50-Wert des monovalenten Immuntoxins (140 pM). Zusätzlich konnte mit einem AnnexinV-Assay für beide Immuntoxine die geforderte Abtötung der Zielzellen über den Weg der Apoptose nachgewiesen werden. Zur Untermauerung der hervorragenden in-vitro ermittelten Toxizitätsdaten erfolgte die in-vivo Testung im Tiermodell an transgenen hCD64+ Mäusen. Beide Immuntoxine zeigten nach Applikation eine drastische Reduktion der lokalen CD64+ Makrophagenpopulationen in chronisch entzündeter Maushaut. Auch hier zeigte sich das bivalente Immuntoxin überlegen: mit H22(scFv)ETA´ sank die Anzahl der CD64+ Makrophagen auf 21%, wogegen eine Behandlung mit H22(scFv)2ETA´ die Anzahl der CD64+ Makrophagen auf nur 4,8% senken konnte. Die Anzahl an überlebenden Zellen nach Immuntoxinapplikation war signifikant (*p>0,001). Damit sind die Tierdaten statistisch als eindeutig anzusehen. Zusammengefasst betrachtet ist zu sagen, dass beide rekombinanten Immuntoxine niedrige IC50- Werte haben, die sie für eine Behandlung von Krankheiten mit dysregulierten, aktivierten Makrophagen auszeichnet. Diese Daten zeigen zum ersten Mal, dass das bivalente Immuntoxin im Vergleich zum monovalenten Immuntoxin sowohl in-vitro als auch in-vivo eine stärkere Zytotoxizität aufweist. Somit konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine erhöhte Effektivität mit einer erhöhten Valenz eindeutig korreliert